微生物功能性油脂的研究

董欣榮 曹 健

摘要 從影響微生物油脂合成的重要因素、微生物油脂的制備、微生物油脂的定性分析、產品的理化指標和質量指標及利用微生物生產功能性油脂等幾個方面，對國內外微生物功能性油脂的研究進行了綜述。

關鍵詞 微生物；功能性油脂；制取

分類號 TS218.01

FUNCTIONAL FATS AND OILS FROM MICROORGANISMS

Dong Xinrong Cao Jian

(Bioengineering department,Zhengzhou Grain College,Zhengzhou 450052)

Abstract This paper gives a general review of the prod uction of fats and oils from microorganisms,the important factors that work duri ng the process,qualitative analysis,physical and chemical properties and quality properties of the products as well as the microorganism is applied to make the functional oils and fats at home and abroad.The production of functional fats an d oils from microorganisms are also investigated.

Key words microorganism;functional fats and oils;production

0 前言

微生物油脂一般又稱單細胞油脂，很多微生物如細菌、霉菌、酵母菌及藻類等在一定條件下，可在菌體內產生大量油脂，有的干基菌體含油高達70%以上，而且這些油脂與一般植物油脂有類似的脂肪酸組成(見表1)〔1〕。微生物油脂的研究始于第一次世界大戰期間，德國為了解決當時的油源匱乏而利用產脂內孢霉生產油脂，之后美國也開始著手微生物油脂的生產，但沒有實現工業化。直至第二次世界大戰前夕，德國科學家篩選到了適于深層培養的菌株，開始在德國工業化生產微生物食用油。

表1 部分微生物油脂的脂肪酸組成

菌株 12∶0 14∶0 1 6∶0 16∶1 18∶0 18∶1 18∶2 18∶3 其它

假絲酵母(Candidal0) - tr 32 - 15 44 8 -

隱球酵母

(Cryptococcus terricolus) - tr 36 1 14 36 8 tr

紅酵母

(Rhdotorula glatiuis) - - 18 1 6 60 12 2 24∶0 1%

Rhythium irregulare 1 6 26 15 5 26 5 6a 20∶0 7%

產脂內孢霉 - 2 25 70 17 47 5 1

麥角菌霉 - tr 23 6 2 19 8 - 18∶1-OH 42%

串珠鐮孢 - 1 14 - 11 30 42 1

米黑毛霉 - 1 20 4 6 48 16 5a

少根根霉 tr 1 18 4 11 29 16 tra

淀粉核衣藻 - - 30.7 2.6 0.8 4.1 35.3 7.5b 16∶2 16.2%

16∶3 2.7%

高山被孢霉

Ovder Mucorales b b b b b b 15 0

20∶3 3%

20∶4 30%

20∶5 15%

說明：a――γ―亞麻酸；b――未知；tr――痕量；br――支鏈酸；-― ―OH羧基酸

與動植物油的生產相比，微生物油脂的生產有許多優點：1、微生物適應性強，繁殖速度快 ，生產周期短；2、微生物生長所需的原料豐富多樣，特別是可以利用農副產品、食品工業及造紙業中產生的廢棄物，如亞硫酸紙漿、木材糖化液、廢糖液、制造淀粉產生的廢料廢液等，同時還保護了環境；3、微生物方法生產油脂可節約勞動力，同時不受場地、氣候、季節的影響，一年四季可連續生產；4、利用不同的菌種和培養基產品構成變化較大的特點，尤其適合于開發一些功能性油脂。如富含油酸、γ―亞麻酸、花生四烯酸、EPA、DHA、角鯊烯、二元羧酸等的油脂以及代可可脂。此外，由于人口的增長使得油脂需求量與自然資源嚴重短缺的矛盾日益尖銳，開辟新油源―微生物油脂更具有重要的現實意義〔2、3〕 。

目前利用微生物生產油脂的技術可行性已不存在太大問題，主要還是經濟可行性。微生物生 產油脂受多種因素影響，而且生產油脂的菌種有限，只有那些干基菌體含油率高，油脂轉化率也較高的微生物才有可利用的價值。目前篩選的微生物干基菌體含油率一般為30%～60%，少數為70%～80%。油脂轉化率一般為15%，個別菌種達20%～25%。因此，一般的微生物油脂經濟價值還無法與植物油相抗衡，對微生物油脂的研究主要集中在利用微生物生產經濟價值高的特殊營養油脂、特殊工業用途油脂。這類油脂的主要營養成分在天然動植物油脂中存在量很少，甚至不存在，但具有較大的生理功能和特殊用途，因而我們統稱為微生物功能性油脂。目前通過微生物油脂分提制取可可脂、采用酵母發酵生產代可可脂都已在日本得以實現，以霉菌生產的γ―亞麻酸油脂已在日、英問世，生產富含花生四烯酸、二十碳五烯酸、二十二碳六烯酸、中碳酸及蓖麻酸油脂的真菌、藻類菌種也已找到〔1，6，21〕。微生物功能 性油脂作為動植物油脂的必要補充在促進人類健康方面正起著越來越重要的作用，所以對微 生物功能性油脂的研究具有極其重大的意義。

1 影響微生物油脂合成的重要因素

1.1 培養基的C/N比

油脂的生成由細胞油脂含量與細胞收獲量的乘積決定。微生物生產油脂的 過程可分為兩階段：細胞增殖階段和產油階段。這兩個階段所用培養基的C/N比不同，細胞增殖期要 求氮素營養相對偏高以獲取足量菌體細胞；產油期則是在獲取足量菌體細胞后，增加碳素營養物 質，為菌體大量積油創造條件〔9〕。

1.2 pH值

產生油脂的最適pH值依微生物種類而不同，酵母為3.5～6.0，霉菌為中 性至偏堿性。構巢曲霉在pH2．8～7.4培養時，隨pH值上升，油酸含量增加。而培養油脂 酵母的增養基最初pH值越接近中性，穩定期細胞油脂含量越高〔7〕。

1.3 無機鹽和微量元素

一般地對于真菌，適當增加無機鹽和微量元素的使用量，可提高產油速度 及產油量。Carrid等人對構巢曲霉的研究表明，調整Na＋、Mg2＋、SO42－ 、PO43－等離子的含量比，可使油脂含量由25%～26%(生成率6.7～7.9)提高到51 %(生成率17.2)。一項有關油脂酵母產油的實驗證明，在培養基中增加鐵離子濃度可加快油 脂合成，而增加鋅離子濃度(有些菌株要求維生素B)可提高積累量。

1.4 溫度

油脂生成的最適溫度大多在25℃左右。溫度可影響油脂的組成、含量，培 養溫度低時不飽和脂肪酸含量將增加。

1.5 培養時間

培養時間對油脂的合成也很重要。如黑曲霉、米曲霉、根霉、紅酵母、釀 酒酵母 最佳培養時間分別為3d、7d、7d、5d、6d。培養時間不足，微生物菌體總數達不到最 大量而影響油脂量；培養時間過長，微生物個體變形、自溶，形成的油脂進入培養基中難以 收集，同樣影響油脂產量。

1.6 孢子數量

菌體生長期孢子數量過多，單細胞油脂產量反而可能低。細胞內積存的油 脂過多，又會使菌體失去增殖能力。因此培養產油菌時應使之達到最佳孢子數量，以保持菌 體的增殖能力和產油生理狀態。

1.7 氧氣供給量

微生物利用基質糖類合成油脂及不飽和脂肪酸都需要氧氣參與，因此必須供應充足的氧氣。

1.8 添加

添加脂肪酸合成的中間物或能形成中間物的二碳化合物如乙醇、乙酸鹽、乙醛等可增加油脂含量。

2 微生物油脂的制備

2.1 菌株的選擇

用于生產微生物油脂的菌株要求具備以下條件：

(1)具備或改良后具備合成油脂的能力，油脂積累量大，含油量穩定在50%以上且油 脂轉化率不低于15%。

(2)能利用農副產品及工業廢水、廢料。

(3)繁殖力旺盛，雜菌污染困難，沉淀、過濾、分離油脂容易。

(4)油脂風味良好，食用無害，易消化吸收。

(5)用于工業化生產時能適應工業化深層培養，裝置簡單〔4，5〕。此 外菌種不同，培養條件不同，產品也不同。一些菌株油脂的脂肪酸組成、類型及甘三酯組成 見表1和表2。

表2 微生物油脂的立體專一分析

油脂 Sn 14∶0 16∶0 16∶1 17∶0 17∶1 18∶0 18∶1 18∶2 19tr 20∶0 22∶0 24∶0 24∶1

Mycobacterium 1 1 8 9 tr 2 7 60 - 7 1 1 1 1

snegmatis 2 7 57 13 2 1 6 9 - 1 tr tr 1 tr

3 1 7 7 tr tr 16 18 - 6 7 7 18 7

(油脂酵母) 1 3 14 8 - - 4 61 10 10 - - - -

Lipomyces 2 - 1 2 - - - 88 9 - - - - -

lipoferus 3 6 29 13 - - 9 37 6 - - -

- -

2.2 培養基

需配制的培養基有斜面培養基、種子液培養基、基礎搖瓶培養基、發酵培養基等。斜面培養基是培養該菌種的普通培養基；種子培養基與基礎培養基成分變化不大 ，主要是為了穩定菌種的性狀；發酵培養基要使碳源比重增加，氮源比重下降，同時增加通氣量，使菌體充分合成油脂〔28，29〕。

配制時所用的碳源有乳糖、葡萄糖、果糖、蔗糖、石蠟、廢糖蜜、紙漿工業廢水、木材水解 液、淀粉廠廢水等；氮源有銨鹽、尿素、硝酸鹽、氨基酸、酵母水、玉米漿等；無機鹽類有KH2 PO4、MgSO4、CaCl2等；生長素有酵母膏、蛋白胨等；如果要誘變改良菌種，還需配制誘變培養基，所用的誘變劑有亞硝基胍、N―甲基―N―亞硝基胍、硫酸二乙酯、紫外線、激光、離子束等。

2.3 培養方法

2.3.1 菌種的活化

將保存的菌種轉接到斜面培養基上，28 ℃培養4 d。

2.3.2 種子液的制備

活化菌種以少量無菌水洗，入裝有種子液培養基的三角瓶中，24～30 ℃ ， 轉速150～300 r/min，培養2～5 d。培養溫度、時間、搖瓶速度依菌種的類型和數 量而定，通常種子液培養基裝液量為三角瓶的1/5。

2.3.3 搖瓶培養

采用與(2)同樣容積的三角瓶，內裝1/5容積的種子液培養基，接入種子液 2～3 mL，溫度、轉速同(2)，培養時間比(2)延長1～2 d。

2.3.4 大罐發酵

裝液量為灌體的2/3，接種5%，罐壓0.5 kg/cm2，攪拌速度提高至原來的2倍，罐溫與上述溫度相同。有時為了逐漸誘導產脂，可采用三級發酵的方法，使培養 基營養的供給趨向于碳源逐漸升高，氮源逐漸減少，通氣量加大，pH值也逐漸接近微生物合 成油脂的最適值。

2.4 菌體的收集

培養好的菌體經鏡檢后，以濾布(紗布、的確涼布)過濾，用蒸餾水洗三次 ，稱濕重，取部分濕菌體60 ℃烘干，稱干重，以確定濕菌體的含水率。收集大量菌體時則 采用離心法。

2.5 提油前菌體的前處理及菌體油脂的提取

微生物油脂存在于堅韌的細胞壁中，且部分以脂蛋白、脂多糖的形式存在 ，因此提油前必須對菌體進行前處理。前處理的方法主要有四種：(1)干菌體磨碎法(將菌體 與砂子一起進行研磨)；(2)干菌體、稀鹽酸共煮法(共煮使細胞分解便于獲油)；(3)菌種自 溶法(50 ℃下保溫2～3 d)；(4)菌體蛋白變性法(用乙醇或丙醇使結合蛋白變性)〔10〕 。另外還有利用高壓勻漿、球磨、膨化、高滲透壓等處理使菌體破裂的辦法。

用于油脂浸提的有機溶劑主要有乙醚、異丙醚、氯仿、乙醚―乙醇、石油醚、氯仿―甲醇等 ，浸提后再通過減壓蒸餾等手段回收溶劑。

3 微生物油脂定性分析

經蘇丹黑染色法染色后，菌體中的脂肪粒呈現藍紫色或藍灰色，而菌體 為紅色。根據脂肪粒大小可初步判斷脂肪含量的多少，還可用于確定最佳產油時間〔5〕。

4 微生物油脂各項理化指標與質量指標的測定

采用AOCS方法，分析指標主要包括以下幾方面：(1)折光指數；(2) 比重； (3)透明度；(4)氣味、滋味；(5)水分；(6)酸價；(7)過氧化值；(8)碘價；(9)色澤；(10)2 80℃實驗；(11)脂肪酸組成；(12)甘三酯組成；(13)不皂化物。

5 利用微生物制取功能性油脂

通過細胞融合、細胞誘變等手段，可使微生物生產出比動植物油脂 更符合人體需要的高營養油脂或某些特定脂肪酸組成的油脂〔27〕。現分述如下：

5.1 油酸、亞油酸

亞油酸是一種人體必需脂肪酸，通過人體的△6脫氫酶作用可以轉 變成 人體所需的γ―亞麻酸。盡管這類油脂在植物中存在較為普遍，但亞油酸含量達到70%以上 的只有紅花油、葵花油。據報道利用纖維素作碳源來培養絲狀菌馬鈴薯黑痣病薄膜霉 ，所產 生的油脂亞油酸含量高達71.8%～76.3%〔11〕。國外資料報道有利用產脂內孢霉 工業化生產富含油酸、亞油酸的油脂。微生物油脂中油酸、亞油酸常常同時存在，二者可占 總脂量的65%～78%，這一點與許多植物油脂非常相似，此外熔點、折射率、比重、酸價、過 氧化值、皂化值、碘值等物理化學特性的分析結果，也與植物油接近〔9〕。

一份關于38株假絲酵母的全細胞脂肪酸分析表明：這些酵母油酸含量達34%～69%，亞油酸含 量達5%～34%，而且有的菌株棕櫚油酸含量達15.9%〔2，3〕。油脂酵母、紅酵母、 擲孢酵母合成的油脂以油酸為主要成份，脂肪酸組成與常用植物油中的橄欖油、菜籽油相近 〔2，13〕。

5.2 γ―亞麻酸(GLA)

GLA天然存在量很少，只有在乳脂和特殊野生植物種子中含量較高，人體 △6脫氫酶的存在及活力常受肥胖、癌癥、 病毒感染、老齡等健康及營養因素的影響，阻礙攝入的亞油酸轉變為GLA，使PG(前列 腺素)不能順利合成，從而導致動脈硬化、血栓癥、糖尿病等，故富含GLA的油脂是一類保健 性油脂〔14〕。

傳統上，GLA主要從月見草種子油中提取，1948年Bernhard和Albercht首先從布拉克須霉的 菌絲體脂肪中鑒定出真菌CLA，含量達16%，Nugtern證明其結構與月見草種子油GLA相似。19 64年Show又發現藻狀菌綱的菌株含有GLA，而不含α-亞麻酸。最近，日本Ona da Cement公司生物工程研究室的Morio Hiramo和東京農業與技術大學生物工程系的Yunki M iura等利用新鮮海水培養鈍頂螺旋藻和一種小球藻(Chlorella sp.NKG4240)生產GLA， 其含量可達總脂肪酸的10%〔15〕。

在發酵生產GLA方面，1985年Osama Suzuki等利用深黃被孢霉、葡酒色被孢霉，拉曼被孢霉 和矮被孢霉以高 濃度葡萄糖(60～400 g/L)為碳源發酵培養，菌體油脂含量達35%～70%，其中GLA占3%～11% 。 1987年蓑島良一等用雅致小克銀漢霉發酵生產GLA，GLA含量達18%。英國使用爪哇鐮刀菌， 以小麥淀粉生產的葡萄糖作為培養基進行發酵，產物經提純達到食用標準，γ―甘油三亞麻 酸酯含量高達16%。利用發酵法生產γ―亞麻酸酯的John & Starge有限公司產量達100 t/a 〔4，26〕。1986年以來，英國Sslby factory of sturge Biochemicals、日本出光 化 學公司已有微生物GLA產品上市，主要用于醫藥、保健食品、功能性飲料和高級化妝品 〔11〕。

我國上海工業微生物研究所在500L發酵罐中用M102菌株發酵生產GLA，GLA含量達到8% 。1993年，南開大學生物系用深黃被孢霉As3.3410為出發菌株，經紫外誘變得變異株，在1 0L 罐中發酵產生GLA時，菌體得率為29.3%，油脂含量達44.7%，其中GLA含量達9.44%〔 12〕；1998年福建師范大學生物工程學院以深黃被孢霉As3.31410為出發菌株，經紫外 、硫酸二乙酯、亞硝基胍復合誘變處理后，進行了60m3罐三級發酵，菌體油脂含量高達79 .2%〔16〕。

5.3 花生四烯酸(AA)

AA傳統上來自魚油，但含量極低，一般小于0.2%(W/W)。AA與二十碳五烯 酸(EPA)是花生酸代謝的重要中間產物，它們在營養學、醫學上的地位為世人矚目，這主要 是 由于二十碳酸代謝產物PG、TX、LT具有調節脈管阻塞、血栓、傷口愈合、炎癥及過敏等生理 功能〔1〕。1990年Buranova等發現幾株被孢霉能聚集二十碳三烯酸(DGLA又稱二高γ ―亞麻酸)和AA，并且在一定條件下生產EPA。80年代以來，GLA、AA含量高的微生物油脂 相繼在日本、英國、法國、新西蘭等國投入工業化生產，日本、英國已有AA發酵產品投入市 場〔17〕。國內朱法科等以一株被孢霉為出發菌株，通過紫外誘變得到一株AA高產菌 ，AA得率達0.83g/L。研究還指出：培養不同時間的菌絲(3d～5d)在室溫下老化15d，菌絲 體中總脂含量由18%～30%上升至36%～41%；菌絲體中AA含量則由1.1%～2.6%上升至2.6%～ 3.7%〔18〕。

5.4 二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)

天然EPA、DHA通常在海洋動物和海洋浮游植物中含量豐富。EPA、DHA屬于 ω―3多不飽和脂肪酸(PUFA)，其生理功能主要表現在：(1)預防和治療動脈粥狀硬化、血栓 形成及高血壓。(2)治療氣喘、關節炎、周期性偏頭痛、牛皮癬、腎炎。(3)治療乳腺、前列 腺和結腸癌。目前ω―3PUFA的商業來源是海洋魚及其油。魚油中ω―3PUFA的構成與含量隨 魚種類、季節、地理位置等變化；為了提高其氧化穩定性，多數魚油常常要經過氫化、調和 等步驟從而使EPA、DHA受到破壞。

1988年Shimizu等人提出高山被孢霉是生產EPA的一個潛在來源，在12℃的低溫條件下生長時 ，可積累15%以上的EPA。Thraustochytrium aureum則是一種海生真菌，DHA含量達34%。許 多 海生藻可產高含EPA和DHA的油脂。金藻綱、黃藻綱、哇藻綱、紅藻綱、褐藻綱、綠藻綱、綠 枝藻綱、 隱藻綱、Eustigmatoohyceae中的一些藻都高含EPA；甲藻綱的藻DHA含量高，而甲藻綱 中Amphidinium carteri的EPA和DHA含量都很高〔15〕。

培養基組成、通氣、光強、溫度、培養時間等對EPA、DHA等PUFA的合成、積累起著重要作用 ，氮源的數量影響飽和與不飽和脂肪酸的比例，光照不足將增加ω―6脂肪酸的合成和抑制 ω―3脂肪酸的合成，對數生長期末尾或在穩定期的開始時微生物PUFA的濃度達到最大。 此外使用基因工程選育菌種，有可能大大增加藻類、真菌產生EPA、DHA及其他PUFA的潛力， 而且藻油中的EPA比魚油中有著更大的氧化穩定性，且沒有魚油的氣味和滋味。

表3 可生產類可可脂的微生物

菌種 干菌體量

PC/g.L－1 脂質含

量/% 脂肪酸組成/% 1、3-二飽和、3不飽

和甘 油酯含量/%

16∶0 18∶0 18∶1

紅冬孢酵母

(Rhodosporidium toruloi des） 12.8 59.8 25.0 12.7 46.4 47.9

紅酵母(Rhodotorula glaminis) 8.0 35.8 29.8 11.8 35.5 32.8

產脂內孢霉 8.5 10.4 25.1 12.3 47.1 30.6

被孢霉(Mortierella vinacea ) 5.0 33.7 27.9 12.7 48.0

被孢霉(MM nana) 4.5 51.3 25.1 16.6 44.4

被孢霉(M.ramanianaver

anguispora) 3.2 13.4 28.1 16.6 40.8

5.5 長鏈二元酸

長鏈二元酸在工業上有廣泛的用途，是生產聚合體、粉末涂料、可塑劑、 潤滑油、香料、農藥等的出發原料和中間體。C10以下的短鏈二元羧酸在自然界存在 廣泛，合成較為容易，但C11以上的長鍵二元羧酸幾乎沒有天然存在的，合成也很 困難。很多微生物經發酵可得到C11～C18飽和及不飽和二元酸，這方面的應用 在日本最為廣泛，且經使用效果良好。

5.6 角鯊烯

角鯊烯資源也非常短缺，主要存在于深海鯨魚和鯊魚肝油中，橄欖油和米 糠油中含量也較高。角鯊烯在油中具有抗氧化作用，但它全氧化后又成為助氧劑。其氫化物 是優良的化妝品基質和鐘表等精密機械的潤滑劑。以癸烷為碳源，利用深黃被孢霉發酵得到 的油脂，角鯊烯含量可達50mg/L。

5.7 代可可脂

可可脂是世界上最貴重的油脂之一，天然可可脂是以可可豆為原料經清洗 、去皮，水壓法提取而得到的，其甘三酯組成為POS52%、SOS19%、POP6%。天然可可脂具有 風味良好、不易氧化且不被脂解酶分解、加工粘度適合、易于脫模等特性，成為制取巧克力 不可缺少的一種油脂成分。由于天然可可脂貨源不足且價格昂貴，因此出現了多種多樣的類 可可脂、代可可脂。利用微生物制取可可脂包含兩方面的內容：(1)利用微生物酶作為催化 劑，催化油脂酯交換，達到可可脂要求的甘三酯組成，用這種方法可制得類可可脂。(2)培 養微生物菌株，使其在菌體內產生理化性質或甘三酯組成與可可脂接近的類可可脂和代可可 脂。

莫斯科工業研究所利用紅酵母屬、紅冬孢酵母屬、隱球酵母屬菌株生產油脂 的一 項研究表明：Rhodotorula gracilis K-76及Rhodosporidum sphaerocarpum L-103產生 的2 位為油酸的甘三脂產量很高，經分提得到的油脂理化性質近似于可可脂、橄欖油、棉籽油； 荷蘭利用假絲酵母屬、類酵母屬、紅酵母屬 油脂酵母屬等14個屬的酵母變異種生產可可脂 及其代用品，以N-甲基-N-亞硝基胍誘變后得到高產菌種，經培養油脂含量達30%，且其中95 %的甘三酯具有P 37.6%、S 14.3%、O 37.5%的脂酸肪組成〔21〕；加拿大以脫 蛋白乳清為培養基培養酵母，通過添加所需晶型得到了甘三酯組成及含量與可可脂相似的類 可可脂，并且不經分提即可市售，產品均勻穩定〔22〕。

在利用微生物合成可可脂方面研究最多的是日本。在一項專利中，將乳酸桿菌、雙歧桿菌菌 種接種到一種由油、脂、發酵的奶粉、糖類制成的混合物中，并按比例添加有全奶粉、蔗糖 、乳糖、磷脂、香料、檸檬酸及天然色素，在低于45℃的條件下發酵后，所得產品經感官檢 驗具酸乳酪味，可代替可可脂用于食品中〔23〕。

還有一項專利是將一種對蘋婆酸及其衍生物敏感的假絲酵母進行搖瓶培養，培養后測得其甘 三酯組成中POP占18.6%、POS占39.0%、SOS占14.6%，可作為可可脂使用〔24〕 。另有一項專利使用被孢霉生產代可可脂，成效也非常顯著〔25〕。

綜上所述，微生物功能性油脂的研究是21世紀的發展方向，它將使油脂行業的范圍更廣 ，也將使微生物應用到更為廣闊、重要的領域。

作者簡介：董欣榮：女，1973年生，碩士研究生

作者單位：鄭州糧食學院生物工程系，鄭州 450052

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23 Hideki Baba,etc.Eur Pat Appl,EP 704164.Appl.1994/215：1～12

24 Ofuji,etc.Jpn.Kokai Tokkyo Koho JP 61282091 Appl.1985/125.818：605～609

25 Agency of Industrial Sciences and Technology.Jpn.Kokai Tokkyo Koho JP 607529 2 Appl.1983/160753：473～475

26 張秀魯，陳霄，吳昕等．發酵法生產高含量γ―亞麻酸油脂的研究．中國糧油學報，1993，(2)：24～29

27 李小松，余揚帆等．微生物油脂．食品科技，1997(5)：8～9

28 楊宏，林娟，歐陽瑞珍．產油微生物的培養．福州大學學報，1997，25(5)：103～106

29 陳少洋．酵母菌變異株M413的培養及發酵培養基的優選．福州大學學報，1997，25(5) ：107～110

收稿日期

油脂水解試驗分類:細菌

某些細菌能夠分泌脂肪酶（胞外酶），能將培養基中的脂肪水解為甘油和脂肪酸。所產生的脂肪酸，可通過預先加入油脂培養基中的中性紅加以指示[指示范圍pH6.8（紅）～pH8.0（黃）]。當細菌分解脂肪產生脂肪酸時，培養基中出現紅色斑點。

（1）將裝有油脂培養基的錐形瓶置于沸水浴中融化，取出并充分振蕩（使油脂均勻分布），再傾入培養皿中，待凝固后制成平板。

（2）翻轉平板使底皿背面向上，用記號筆在其背面玻璃上劃成兩半。一半用于接種金黃色葡萄球菌作為陽性對照菌，另一半用于接種實驗菌大腸桿菌或產氣腸桿菌。接種時用接種環取少量菌在平板兩邊各劃線接種。

（3）將接種完的平板倒置于37℃恒溫箱中，培養24h。

（4）觀察結果時，注意觀察平板上長菌的地方，如出現紅色斑點，即說明脂肪已被水解，此為陽性反應。

微生物油脂一般又稱單細胞油脂，很多微生物如細菌、霉菌、酵母菌及藻類等在一定條件下，可在菌體內產生大量油脂，有的干基菌體含油高達70%以上，而且這些油脂與一般植物油脂有類似的脂肪酸組成(見表1)〔1〕。微生物油脂的研究始于第一次世界大戰期間，德國為了解決當時的油源匱乏而利用產脂內孢霉生產油脂，之后美國也開始著手微生物油脂的生產，但沒有實現工業化。直至第二次世界大戰前夕，德國科學家篩選到了適于深層培養的菌株，開始在德國工業化生產微生物食用油。

1 影響微生物油脂合成的重要因素

1.1 培養基的C/N比

油脂的生成由細胞油脂含量與細胞收獲量的乘積決定。微生物生產油脂的 過程可分為兩階段：細胞增殖階段和產油階段。這兩個階段所用培養基的C/N比不同，細胞增殖期要 求氮素營養相對偏高以獲取足量菌體細胞；產油期則是在獲取足量菌體細胞后，增加碳素營養物 質，為菌體大量積油創造條件〔9〕。

1.2 pH值

產生油脂的最適pH值依微生物種類而不同，酵母為3.5～6.0，霉菌為中 性至偏堿性。構巢曲霉在pH2．8～7.4培養時，隨pH值上升，油酸含量增加。而培養油脂 酵母的增養基最初pH值越接近中性，穩定期細胞油脂含量越高〔7〕。

1.3 無機鹽和微量元素

一般地對于真菌，適當增加無機鹽和微量元素的使用量，可提高產油速度 及產油量。Carrid等人對構巢曲霉的研究表明，調整Na＋、Mg2＋、SO42－ 、PO43－等離子的含量比，可使油脂含量由25%～26%(生成率6.7～7.9)提高到51 %(生成率17.2)。一項有關油脂酵母產油的實驗證明，在培養基中增加鐵離子濃度可加快油 脂合成，而增加鋅離子濃度(有些菌株要求維生素B)可提高積累量。

1.4 溫度

油脂生成的最適溫度大多在25℃左右。溫度可影響油脂的組成、含量，培 養溫度低時不飽和脂肪酸含量將增加。

1.5 培養時間

培養時間對油脂的合成也很重要。如黑曲霉、米曲霉、根霉、紅酵母、釀 酒酵母 最佳培養時間分別為3d、7d、7d、5d、6d。培養時間不足，微生物菌體總數達不到最 大量而影響油脂量；培養時間過長，微生物個體變形、自溶，形成的油脂進入培養基中難以 收集，同樣影響油脂產量。

1.6 孢子數量

菌體生長期孢子數量過多，單細胞油脂產量反而可能低。細胞內積存的油 脂過多，又會使菌體失去增殖能力。因此培養產油菌時應使之達到最佳孢子數量，以保持菌 體的增殖能力和產油生理狀態。

1.7 氧氣供給量

微生物利用基質糖類合成油脂及不飽和脂肪酸都需要氧氣參與，因此必須供應充足的氧氣。

1.8 添加

添加脂肪酸合成的中間物或能形成中間物的二碳化合物如乙醇、乙酸鹽、乙醛等可增加油脂含量。

2 微生物油脂的制備

2.1 菌株的選擇

用于生產微生物油脂的菌株要求具備以下條件：

(1)具備或改良后具備合成油脂的能力，油脂積累量大，含油量穩定在50%以上且油 脂轉化率不低于15%。

(2)能利用農副產品及工業廢水、廢料。

(3)繁殖力旺盛，雜菌污染困難，沉淀、過濾、分離油脂容易。

(4)油脂風味良好，食用無害，易消化吸收。

(5)用于工業化生產時能適應工業化深層培養，裝置簡單〔4，5〕。此 外菌種不同，培養條件不同，產品也不同。一些菌株油脂的脂肪酸組成、類型及甘三酯組成 見表1和表2。

表2 微生物油脂的立體專一分析

油脂 Sn 14∶0 16∶0 16∶1 17∶0 17∶1 18∶0 18∶1 18∶2 19tr 20∶0 22∶0 24∶0 24∶1

Mycobacterium 1 1 8 9 tr 2 7 60 - 7 1 1 1 1

snegmatis 2 7 57 13 2 1 6 9 - 1 tr tr 1 tr

3 1 7 7 tr tr 16 18 - 6 7 7 18 7

(油脂酵母) 1 3 14 8 - - 4 61 10 10 - - - -

Lipomyces 2 - 1 2 - - - 88 9 - - - - -

lipoferus 3 6 29 13 - - 9 37 6 - - -

- -

2.2 培養基

需配制的培養基有斜面培養基、種子液培養基、基礎搖瓶培養基、發酵培養基等。斜面培養基是培養該菌種的普通培養基；種子培養基與基礎培養基成分變化不大 ，主要是為了穩定菌種的性狀；發酵培養基要使碳源比重增加，氮源比重下降，同時增加通氣量，使菌體充分合成油脂〔28，29〕。

配制時所用的碳源有乳糖、葡萄糖、果糖、蔗糖、石蠟、廢糖蜜、紙漿工業廢水、木材水解 液、淀粉廠廢水等；氮源有銨鹽、尿素、硝酸鹽、氨基酸、酵母水、玉米漿等；無機鹽類有KH2 PO4、MgSO4、CaCl2等；生長素有酵母膏、蛋白胨等；如果要誘變改良菌種，還需配制誘變培養基，所用的誘變劑有亞硝基胍、N―甲基―N―亞硝基胍、硫酸二乙酯、紫外線、激光、離子束等。

2.3 培養方法

2.3.1 菌種的活化

將保存的菌種轉接到斜面培養基上，28 ℃培養4 d。

2.3.2 種子液的制備

活化菌種以少量無菌水洗，入裝有種子液培養基的三角瓶中，24～30 ℃ ， 轉速150～300 r/min，培養2～5 d。培養溫度、時間、搖瓶速度依菌種的類型和數 量而定，通常種子液培養基裝液量為三角瓶的1/5。

2.3.3 搖瓶培養

采用與(2)同樣容積的三角瓶，內裝1/5容積的種子液培養基，接入種子液 2～3 mL，溫度、轉速同(2)，培養時間比(2)延長1～2 d。

2.3.4 大罐發酵

裝液量為灌體的2/3，接種5%，罐壓0.5 kg/cm2，攪拌速度提高至原來的2倍，罐溫與上述溫度相同。有時為了逐漸誘導產脂，可采用三級發酵的方法，使培養 基營養的供給趨向于碳源逐漸升高，氮源逐漸減少，通氣量加大，pH值也逐漸接近微生物合 成油脂的最適值。

2.4 菌體的收集

培養好的菌體經鏡檢后，以濾布(紗布、的確涼布)過濾，用蒸餾水洗三次 ，稱濕重，取部分濕菌體60 ℃烘干，稱干重，以確定濕菌體的含水率。收集大量菌體時則 采用離心法。

2.5 提油前菌體的前處理及菌體油脂的提取

微生物油脂存在于堅韌的細胞壁中，且部分以脂蛋白、脂多糖的形式存在 ，因此提油前必須對菌體進行前處理。前處理的方法主要有四種：(1)干菌體磨碎法(將菌體 與砂子一起進行研磨)；(2)干菌體、稀鹽酸共煮法(共煮使細胞分解便于獲油)；(3)菌種自 溶法(50 ℃下保溫2～3 d)；(4)菌體蛋白變性法(用乙醇或丙醇使結合蛋白變性)〔10〕 。另外還有利用高壓勻漿、球磨、膨化、高滲透壓等處理使菌體破裂的辦法。

用于油脂浸提的有機溶劑主要有乙醚、異丙醚、氯仿、乙醚―乙醇、石油醚、氯仿―甲醇等 ，浸提后再通過減壓蒸餾等手段回收溶劑。

3 微生物油脂定性分析

經蘇丹黑染色法染色后，菌體中的脂肪粒呈現藍紫色或藍灰色，而菌體 為紅色。根據脂肪粒大小可初步判斷脂肪含量的多少，還可用于確定最佳產油時間〔5〕。

4 微生物油脂各項理化指標與質量指標的測定

采用AOCS方法，分析指標主要包括以下幾方面：(1)折光指數；(2) 比重； (3)透明度；(4)氣味、滋味；(5)水分；(6)酸價；(7)過氧化值；(8)碘價；(9)色澤；(10)2 80℃實驗；(11)脂肪酸組成；(12)甘三酯組成；(13)不皂化物。

5 利用微生物制取功能性油脂

通過細胞融合、細胞誘變等手段，可使微生物生產出比動植物油脂 更符合人體需要的高營養油脂或某些特定脂肪酸組成的油脂〔27〕。現分述如下：

5.1 油酸、亞油酸

亞油酸是一種人體必需脂肪酸，通過人體的△6脫氫酶作用可以轉 變成 人體所需的γ―亞麻酸。盡管這類油脂在植物中存在較為普遍，但亞油酸含量達到70%以上 的只有紅花油、葵花油。據報道利用纖維素作碳源來培養絲狀菌馬鈴薯黑痣病薄膜霉 ，所產 生的油脂亞油酸含量高達71.8%～76.3%〔11〕。國外資料報道有利用產脂內孢霉 工業化生產富含油酸、亞油酸的油脂。微生物油脂中油酸、亞油酸常常同時存在，二者可占 總脂量的65%～78%，這一點與許多植物油脂非常相似，此外熔點、折射率、比重、酸價、過 氧化值、皂化值、碘值等物理化學特性的分析結果，也與植物油接近〔9〕。

一份關于38株假絲酵母的全細胞脂肪酸分析表明：這些酵母油酸含量達34%～69%，亞油酸含 量達5%～34%，而且有的菌株棕櫚油酸含量達15.9%〔2，3〕。油脂酵母、紅酵母、 擲孢酵母合成的油脂以油酸為主要成份，脂肪酸組成與常用植物油中的橄欖油、菜籽油相近 〔2，13〕。

5.2 γ―亞麻酸(GLA)

GLA天然存在量很少，只有在乳脂和特殊野生植物種子中含量較高，人體 △6脫氫酶的存在及活力常受肥胖、癌癥、 病毒感染、老齡等健康及營養因素的影響，阻礙攝入的亞油酸轉變為GLA，使PG(前列 腺素)不能順利合成，從而導致動脈硬化、血栓癥、糖尿病等，故富含GLA的油脂是一類保健 性油脂〔14〕。

傳統上，GLA主要從月見草種子油中提取，1948年Bernhard和Albercht首先從布拉克須霉的 菌絲體脂肪中鑒定出真菌CLA，含量達16%，Nugtern證明其結構與月見草種子油GLA相似。19 64年Show又發現藻狀菌綱的菌株含有GLA，而不含α-亞麻酸。最近，日本Ona da Cement公司生物工程研究室的Morio Hiramo和東京農業與技術大學生物工程系的Yunki M iura等利用新鮮海水培養鈍頂螺旋藻和一種小球藻(Chlorella sp.NKG4240)生產GLA， 其含量可達總脂肪酸的10%〔15〕。

在發酵生產GLA方面，1985年Osama Suzuki等利用深黃被孢霉、葡酒色被孢霉，拉曼被孢霉 和矮被孢霉以高 濃度葡萄糖(60～400 g/L)為碳源發酵培養，菌體油脂含量達35%～70%，其中GLA占3%～11% 。 1987年蓑島良一等用雅致小克銀漢霉發酵生產GLA，GLA含量達18%。英國使用爪哇鐮刀菌， 以小麥淀粉生產的葡萄糖作為培養基進行發酵，產物經提純達到食用標準，γ―甘油三亞麻 酸酯含量高達16%。利用發酵法生產γ―亞麻酸酯的John & Starge有限公司產量達100 t/a 〔4，26〕。1986年以來，英國Sslby factory of sturge Biochemicals、日本出光 化 學公司已有微生物GLA產品上市，主要用于醫藥、保健食品、功能性飲料和高級化妝品 〔11〕。

我國上海工業微生物研究所在500L發酵罐中用M102菌株發酵生產GLA，GLA含量達到8% 。1993年，南開大學生物系用深黃被孢霉As3.3410為出發菌株，經紫外誘變得變異株，在1 0L 罐中發酵產生GLA時，菌體得率為29.3%，油脂含量達44.7%，其中GLA含量達9.44%〔 12〕；1998年福建師范大學生物工程學院以深黃被孢霉As3.31410為出發菌株，經紫外 、硫酸二乙酯、亞硝基胍復合誘變處理后，進行了60m3罐三級發酵，菌體油脂含量高達79 .2%〔16〕。

5.3 花生四烯酸(AA)

AA傳統上來自魚油，但含量極低，一般小于0.2%(W/W)。AA與二十碳五烯 酸(EPA)是花生酸代謝的重要中間產物，它們在營養學、醫學上的地位為世人矚目，這主要 是 由于二十碳酸代謝產物PG、TX、LT具有調節脈管阻塞、血栓、傷口愈合、炎癥及過敏等生理 功能〔1〕。1990年Buranova等發現幾株被孢霉能聚集二十碳三烯酸(DGLA又稱二高γ ―亞麻酸)和AA，并且在一定條件下生產EPA。80年代以來，GLA、AA含量高的微生物油脂 相繼在日本、英國、法國、新西蘭等國投入工業化生產，日本、英國已有AA發酵產品投入市 場〔17〕。國內朱法科等以一株被孢霉為出發菌株，通過紫外誘變得到一株AA高產菌 ，AA得率達0.83g/L。研究還指出：培養不同時間的菌絲(3d～5d)在室溫下老化15d，菌絲 體中總脂含量由18%～30%上升至36%～41%；菌絲體中AA含量則由1.1%～2.6%上升至2.6%～ 3.7%〔18〕。

5.4 二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)

天然EPA、DHA通常在海洋動物和海洋浮游植物中含量豐富。EPA、DHA屬于 ω―3多不飽和脂肪酸(PUFA)，其生理功能主要表現在：(1)預防和治療動脈粥狀硬化、血栓 形成及高血壓。(2)治療氣喘、關節炎、周期性偏頭痛、牛皮癬、腎炎。(3)治療乳腺、前列 腺和結腸癌。目前ω―3PUFA的商業來源是海洋魚及其油。魚油中ω―3PUFA的構成與含量隨 魚種類、季節、地理位置等變化；為了提高其氧化穩定性，多數魚油常常要經過氫化、調和 等步驟從而使EPA、DHA受到破壞。

1988年Shimizu等人提出高山被孢霉是生產EPA的一個潛在來源，在12℃的低溫條件下生長時 ，可積累15%以上的EPA。Thraustochytrium aureum則是一種海生真菌，DHA含量達34%。許 多 海生藻可產高含EPA和DHA的油脂。金藻綱、黃藻綱、哇藻綱、紅藻綱、褐藻綱、綠藻綱、綠 枝藻綱、 隱藻綱、Eustigmatoohyceae中的一些藻都高含EPA；甲藻綱的藻DHA含量高，而甲藻綱 中Amphidinium carteri的EPA和DHA含量都很高〔15〕。

培養基組成、通氣、光強、溫度、培養時間等對EPA、DHA等PUFA的合成、積累起著重要作用 ，氮源的數量影響飽和與不飽和脂肪酸的比例，光照不足將增加ω―6脂肪酸的合成和抑制 ω―3脂肪酸的合成，對數生長期末尾或在穩定期的開始時微生物PUFA的濃度達到最大。 此外使用基因工程選育菌種，有可能大大增加藻類、真菌產生EPA、DHA及其他PUFA的潛力， 而且藻油中的EPA比魚油中有著更大的氧化穩定性，且沒有魚油的氣味和滋味。

表3 可生產類可可脂的微生物

菌種 干菌體量

PC/g.L－1 脂質含

量/% 脂肪酸組成/% 1、3-二飽和、3不飽

和甘 油酯含量/%

16∶0 18∶0 18∶1

紅冬孢酵母

(Rhodosporidium toruloi des） 12.8 59.8 25.0 12.7 46.4 47.9

紅酵母(Rhodotorula glaminis) 8.0 35.8 29.8 11.8 35.5 32.8

產脂內孢霉 8.5 10.4 25.1 12.3 47.1 30.6

被孢霉(Mortierella vinacea ) 5.0 33.7 27.9 12.7 48.0

被孢霉(MM nana) 4.5 51.3 25.1 16.6 44.4

被孢霉(M.ramanianaver

anguispora) 3.2 13.4 28.1 16.6 40.8

5.5 長鏈二元酸

長鏈二元酸在工業上有廣泛的用途，是生產聚合體、粉末涂料、可塑劑、 潤滑油、香料、農藥等的出發原料和中間體。C10以下的短鏈二元羧酸在自然界存在 廣泛，合成較為容易，但C11以上的長鍵二元羧酸幾乎沒有天然存在的，合成也很 困難。很多微生物經發酵可得到C11～C18飽和及不飽和二元酸，這方面的應用 在日本最為廣泛，且經使用效果良好。

5.6 角鯊烯

角鯊烯資源也非常短缺，主要存在于深海鯨魚和鯊魚肝油中，橄欖油和米 糠油中含量也較高。角鯊烯在油中具有抗氧化作用，但它全氧化后又成為助氧劑。其氫化物 是優良的化妝品基質和鐘表等精密機械的潤滑劑。以癸烷為碳源，利用深黃被孢霉發酵得到 的油脂，角鯊烯含量可達50mg/L。

5.7 代可可脂

可可脂是世界上最貴重的油脂之一，天然可可脂是以可可豆為原料經清洗 、去皮，水壓法提取而得到的，其甘三酯組成為POS52%、SOS19%、POP6%。天然可可脂具有 風味良好、不易氧化且不被脂解酶分解、加工粘度適合、易于脫模等特性，成為制取巧克力 不可缺少的一種油脂成分。由于天然可可脂貨源不足且價格昂貴，因此出現了多種多樣的類 可可脂、代可可脂。利用微生物制取可可脂包含兩方面的內容：(1)利用微生物酶作為催化 劑，催化油脂酯交換，達到可可脂要求的甘三酯組成，用這種方法可制得類可可脂。(2)培 養微生物菌株，使其在菌體內產生理化性質或甘三酯組成與可可脂接近的類可可脂和代可可 脂。

莫斯科工業研究所利用紅酵母屬、紅冬孢酵母屬、隱球酵母屬菌株生產油脂 的一 項研究表明：Rhodotorula gracilis K-76及Rhodosporidum sphaerocarpum L-103產生 的2 位為油酸的甘三脂產量很高，經分提得到的油脂理化性質近似于可可脂、橄欖油、棉籽油； 荷蘭利用假絲酵母屬、類酵母屬、紅酵母屬 油脂酵母屬等14個屬的酵母變異種生產可可脂 及其代用品，以N-甲基-N-亞硝基胍誘變后得到高產菌種，經培養油脂含量達30%，且其中95 %的甘三酯具有P 37.6%、S 14.3%、O 37.5%的脂酸肪組成〔21〕；加拿大以脫 蛋白乳清為培養基培養酵母，通過添加所需晶型得到了甘三酯組成及含量與可可脂相似的類 可可脂，并且不經分提即可市售，產品均勻穩定〔22〕。

在利用微生物合成可可脂方面研究最多的是日本。在一項專利中，將乳酸桿菌、雙歧桿菌菌 種接種到一種由油、脂、發酵的奶粉、糖類制成的混合物中，并按比例添加有全奶粉、蔗糖 、乳糖、磷脂、香料、檸檬酸及天然色素，在低于45℃的條件下發酵后，所得產品經感官檢 驗具酸乳酪味，可代替可可脂用于食品中〔23〕。

還有一項專利是將一種對蘋婆酸及其衍生物敏感的假絲酵母進行搖瓶培養，培養后測得其甘 三酯組成中POP占18.6%、POS占39.0%、SOS占14.6%，可作為可可脂使用〔24〕 。另有一項專利使用被孢霉生產代可可脂，成效也非常顯著〔25〕。

綜上所述，微生物功能性油脂的研究是21世紀的發展方向，它將使油脂行業的范圍更廣 ，也將使微生物應用到更為廣闊、重要的領域。

作者簡介：董欣榮：女，1973年生，碩士研究生

作者單位：鄭州糧食學院生物工程系，鄭州 450052

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28 楊宏，林娟，歐陽瑞珍．產油微生物的培養．福州大學學報，1997，25(5)：103～106

29 陳少洋．酵母菌變異株M413的培養及發酵培養基的優選．福州大學學報，1997，25(5) ：107～110

近年來，我國油脂工業的迅速發展，各種精練食用油產品的大量出現為人們的日常生活帶 來了巨大方便。但是，隨之而來的是油脂加工廠污水廢物的大量產生。食品、造紙等行業排放 的高濃度有機化合物廢水，以及生活廢水對水資源造成很大的污染，危害極大。特別是乳品制 造、油脂生產和肉類加工等食品發酵工廠排放出的高含油污水中COD和BOD都相當高，各物質 種類、含量變化也很復雜，處理相當困難。目前，國內外開發應用的有機物廢水處理技術包括 物理、化學處理法和生物處理法，但物理、化學處理方法由于對BOD去除能力很低等多種原因， 實際應用較少，而主要采用的以活性污泥法為基礎的生物處理技術對于高含油污水的直接處理 能力較低、效果差。

針對高濃度油脂廢水的處理，本研究室采用以酵母混合培養后結合活性污泥處理的二級微 生物降解手法，開發了對于含油脂量高的有機物廢水進行連續降解后達標排放的直接生物凈化 處理技術，可以使常規活性污泥法克服不了的實際困難得以解決。篩選馴化的兩高活性醉母菌 株可以高負荷下持續運轉，分別生產促進油脂形成乳化狀態的生物表面活性物質和水解油脂的 高活性脂肪酶等，直接降解、轉化油脂等有機污染成分，COD, BOD等去除率均在90%以上。 這聯合組成的一體化工程只需常規容積的1/3一1/4，也可以大規模集中處理，起始一次性投資費 用可以減少30%以上，簡易有效。為了進一步強化這一體系中天然活性污泥對含油污水的有效 治理結果，使得各項理化指標全面達到國家污水綜合排放標準，本實驗采用活性污泥馴化再分 離方法，從北京市內污水處理廠家污泥中成功地分離篩選到幾株高效能的細菌菌株，并測定這 些油脂分解細菌的生化特性，為今后將其直接應用于高含油排放污水的微生物連續處理做必要 的基礎研究工作。

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標簽：細菌油脂