第3章 分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)基本操作技術(shù)

這里的實(shí)驗(yàn)基本操作技術(shù)是指在分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中使用范圍最廣、使用頻率最高、幾乎所有實(shí)驗(yàn)都要應(yīng)用的技術(shù)。器皿的清洗，試管、量筒（杯）、容量瓶、吸管及移液器、電子天平等量具的正確操作和使用、試劑配制等技術(shù)，應(yīng)當(dāng)都是基本操作技術(shù)，但這些內(nèi)容已在分析化學(xué)、生物化學(xué)的實(shí)驗(yàn)課程中作了詳細(xì)介紹。本章主要介紹與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)有關(guān)的除（滅）菌技術(shù)、無(wú)菌操作技術(shù)和微量操作技術(shù)。
3.1 除(滅)菌技術(shù)
在進(jìn)行分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，需要一個(gè)清潔的實(shí)驗(yàn)環(huán)境，所使用的器皿及溶液均需要進(jìn)行除（滅）菌處理，一方面避免環(huán)境中微生物的污染，另一方面還可消除蛋白酶和核酸酶對(duì)實(shí)驗(yàn)的干擾和影響。在進(jìn)行微生物及細(xì)胞的純培養(yǎng)時(shí)要求更高，不能有任何外來(lái)雜菌。因此，對(duì)所有器材、培養(yǎng)基要進(jìn)行嚴(yán)格滅菌，對(duì)工作場(chǎng)所進(jìn)行消毒，保證工作順利進(jìn)行。
實(shí)驗(yàn)室常用的除滅菌方法主要有物理方法及化學(xué)方法兩種。物理方法包括用濕熱（高壓蒸汽）、干熱、紫外線、過(guò)濾、離心沉淀等方法除去微生物；化學(xué)方法是使用化學(xué)消毒劑、抗菌素等殺死或抑制微生物。根據(jù)被滅菌物品的材料性質(zhì)和實(shí)驗(yàn)要求，可采取不同的消毒滅菌方法。
3.1.1 物理滅菌法
（1）干熱滅菌：干熱滅菌包括火焰灼燒滅菌和熱空氣滅菌。
火焰灼燒適用于金屬用具，如接種環(huán)、接種針和手術(shù)器械等，玻璃器皿的口頸，如試管口和瓶口，玻璃棒等的滅菌處理。這種方法滅菌迅速?gòu)氐住?br>熱空氣滅菌一般在烤箱中進(jìn)行，利用高溫干燥空氣（160℃?170℃）加熱滅菌1?2h，適用于玻璃器皿和培養(yǎng)皿等。干熱消毒后的器皿干燥，易于保存。缺點(diǎn)是干熱傳導(dǎo)慢，可能有冷空氣存留于烤箱內(nèi)，因此要求較高的溫度和較長(zhǎng)的時(shí)間才能達(dá)到消毒的目的。應(yīng)當(dāng)注意，干烤滅菌完畢后不得馬上將烤箱門(mén)打開(kāi)，須等溫度降至70℃以下時(shí)再開(kāi)箱門(mén)，以免冷空氣突然進(jìn)入，影響消毒效果和損壞玻璃器皿或發(fā)生意外事故。在滅菌時(shí)，物品不能放的太擠。滅菌的玻璃器皿中不可有水，有水的玻璃器皿在干熱滅菌時(shí)容易炸裂。培養(yǎng)基、橡膠制品、塑料制品不能用此方法消毒。
（2）濕熱滅菌：在相同溫度下，濕熱的滅菌效力比干熱滅菌好。原因是：（1）熱蒸汽對(duì)細(xì)胞成分的破壞作用更強(qiáng)。水分子的存在有助于破壞維持蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的氫鍵和其他相互作用弱鍵，更易使蛋白質(zhì)變性。加熱使蛋白質(zhì)變性，與水的含量有關(guān)，當(dāng)環(huán)境和細(xì)胞含水量越大，凝固越快。蛋白質(zhì)含水量與其凝固溫度成反比；（2）熱蒸汽比熱空氣穿透力強(qiáng)，能更有效地殺滅微生物；（3）蒸汽存在潛能，當(dāng)氣體轉(zhuǎn)變成液體時(shí)可放出大量熱能，故可更迅速提高滅菌物體的溫度。
濕熱滅菌常用的方法有高壓蒸汽滅菌、常壓蒸汽滅菌和煮沸滅菌。其中高壓蒸汽滅菌法最為常用，效果最好。常壓蒸汽滅菌法不能在短時(shí)間內(nèi)殺死細(xì)菌芽孢，必須采取間歇滅菌或持續(xù)滅菌的方法，才能達(dá)到完全滅菌。而煮沸滅菌僅用于注射器及某些用具的滅菌，被滅菌物品的濕度太大。所以，這兩種方法較少使用。
高壓蒸氣滅菌是在密閉的高壓蒸汽鍋中進(jìn)行的。其原理是：將待滅菌的物體放置在盛有適量水的高壓蒸汽滅菌鍋內(nèi)，將鍋內(nèi)的水加熱煮沸，并把其中原有的冷空氣徹底驅(qū)盡后將鍋密閉，再繼續(xù)加熱就會(huì)使鍋內(nèi)的蒸汽壓逐漸上升，從而使溫度也隨之上升到100℃以上。
滅菌時(shí)，根據(jù)不同的物品選擇不同壓力和時(shí)間，一般物品（如布類、金屬器械、玻璃器皿等）消毒的要求是0.15MPa下15min，培養(yǎng)液和橡膠制品為0.1MPa下10min。滅菌前在鍋內(nèi)加適量的水，加水過(guò)少，易將滅菌鍋燒干，引起炸裂事故。加水過(guò)多有可能引起滅菌物品浸水。物品不能裝得過(guò)滿，以免影響消毒器內(nèi)氣體流通。導(dǎo)氣管要伸至罐底并防止堵塞。在加熱升壓之前，先要打開(kāi)排氣閥門(mén)排放消毒器內(nèi)的冷空氣，冷空氣排出后，關(guān)閉排氣閥門(mén)，同時(shí)檢驗(yàn)安全閥活動(dòng)自如，開(kāi)始升壓，當(dāng)達(dá)到所需壓力時(shí)，開(kāi)始計(jì)時(shí)，并控制壓力恒定。滅菌過(guò)程中，操作者不能離開(kāi)工作崗位，要定時(shí)檢查壓力及安全，防止意外事件發(fā)生。滅菌完畢后一定要先打開(kāi)閥門(mén)放氣，當(dāng)滅菌鍋內(nèi)壓力下降到“0”時(shí)，再打開(kāi)滅菌鍋的蓋。也可在滅菌完畢后，關(guān)閉電源總閥，讓滅菌物品自然冷卻，待滅菌鍋壓力表降至“0”時(shí)，再取出滅菌物品。

蒸汽壓力與溫度的關(guān)系
蒸汽壓力（表壓） 蒸汽溫度
Kg/cm2 MPa ℃ ℉
0.00 0.00 100 212
0.25 0.025 107.0 224
0.50 0.050 112.0 234
0.75 0.075 115.5 240
1.00 0.100 121.0 250
1.50 0.150 128.0 262
2.00 0.200 134.5 274

（3）紫外線殺菌： 紫外線的波長(zhǎng)范圍是200?300nm，殺菌范圍為240?280nm，其中波長(zhǎng)在260nm左右的紫外線殺菌作用最強(qiáng)。紫外燈是人工制造的低壓水銀燈，能輻射出257.3nm的紫外線，殺菌能力強(qiáng)且較穩(wěn)定。紫外線殺菌作用是因?yàn)樗梢员坏鞍踪|(zhì)（波長(zhǎng)為280nm）和核酸（波長(zhǎng)為260nm）吸收，造成這些分子的變性失活。紫外線穿透能力很差，不能穿透玻璃、衣物、紙張和大多數(shù)其他物體，但能穿透空氣，主要用于實(shí)驗(yàn)室空氣、操作臺(tái)表面和不能使用其它方法進(jìn)行滅菌的物品。紫外線直接照射方便、效果好，經(jīng)一定的時(shí)間照射后，可以消滅空氣中大部分細(xì)菌。培養(yǎng)室紫外線燈應(yīng)距地面不超過(guò)2.5米，且消毒物品不宜相互遮擋，照射不到的地方起不到消毒作用。
紫外線照射可產(chǎn)生臭氧，污染空氣，對(duì)試劑及培養(yǎng)液都有不良影響，對(duì)人皮膚也有傷害。
（4）過(guò)濾除菌：很多液體不能采用高壓滅菌的方法進(jìn)行滅菌處理，如血清、合成培養(yǎng)液、酶及含有生物活性蛋白的液體等，可采用過(guò)濾的方法除去細(xì)菌等微生物。濾器有抽吸（抽濾）式及加壓式兩種類型；濾板（或?yàn)V膜）結(jié)構(gòu)可分為石棉板、玻璃或微孔膜。常用的濾器有Zeiss濾器（蔡氏濾器）、玻璃濾器和微孔濾膜濾器，其中微孔濾膜濾器最為常用。
微孔濾膜濾器多為塑料結(jié)構(gòu)，分為上下兩部分，中間可放置纖維素濾膜。將待過(guò)濾液體吸入注射器內(nèi)，慢慢注入濾器上部的孔中，通過(guò)中間的濾膜即可。可用于包括血清在內(nèi)的各種培養(yǎng)液的過(guò)濾除菌，速度快，效果好。濾膜為一次性的特制混合纖維素濾膜，其孔徑有0.6μm、0.45μm、0.22μm三種，用于過(guò)濾除菌時(shí)，最好選用0.22μm的濾膜（可以除去細(xì)菌和霉菌）。安裝濾膜時(shí)要注意：先將濾膜在蒸餾水中浸濕再安裝；濾膜薄且光滑，容易移動(dòng)，千萬(wàn)不能裝偏而使過(guò)濾失敗；同時(shí)要注意濾膜的正反面，正面（光面）應(yīng)朝上。由于濾膜薄，承受壓力有限，壓力不能過(guò)大、過(guò)猛，以免造成濾膜破裂。每次過(guò)濾后應(yīng)打開(kāi)濾器，核實(shí)濾膜是否移動(dòng)和破裂，以保證有效過(guò)濾除菌。微孔濾膜濾器的清洗、消毒方法很簡(jiǎn)單，用完后去掉濾膜，用去離子水沖洗干凈，再將新的濾膜正確放入其中，包裹后可高壓滅菌處理，也可直接煮沸滅菌處理。現(xiàn)在也有一次性小濾器。
3.1.2 化學(xué)滅菌法
應(yīng)用化學(xué)制劑破壞細(xì)菌代謝機(jī)能。常用化學(xué)殺菌劑有：乙醇、醋酸、福爾馬林、高錳酸鉀、新潔爾滅等。最常見(jiàn)的是75%酒精及1‰的新潔爾滅，前者主要用于操作者的皮膚，操作臺(tái)表面及無(wú)菌室內(nèi)的壁面處理。后者則主要用于器械的浸泡及皮膚和操作室壁面的擦試消毒。化學(xué)滅菌法操作簡(jiǎn)單、方便有效。
將高錳酸鉀粉末與適量體積的福爾馬林混合，會(huì)產(chǎn)生大量的甲醛氣體，常用于無(wú)菌室的熏蒸消毒。
3.1.3抗生素滅菌法
主要用于培養(yǎng)用液滅菌或預(yù)防培養(yǎng)物污染。要注意不能完全依賴抗生素來(lái)達(dá)到消毒滅菌的目的，還應(yīng)嚴(yán)格無(wú)菌操作。常用的抗生素是青霉素和鏈霉素。
3.2無(wú)菌操作技術(shù)
無(wú)菌技術(shù)是指實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，防止一切微生物侵入機(jī)體和保持無(wú)菌物品及無(wú)菌區(qū)域不被污染的操作技術(shù)和管理方法，是實(shí)驗(yàn)過(guò)程中預(yù)防和控制交叉污染的一項(xiàng)重要基本操作。在生化實(shí)驗(yàn)中經(jīng)常涉及到無(wú)菌操作技術(shù)，尤其是微生物的純培養(yǎng)、細(xì)胞及胚胎的培養(yǎng)，更需要嚴(yán)格的無(wú)菌操作技術(shù)。在無(wú)菌操作過(guò)程中，任何一個(gè)環(huán)節(jié)都不得違反操作原則，否則就可能造成實(shí)驗(yàn)失敗。因此，必須加強(qiáng)無(wú)菌觀念，準(zhǔn)確熟練地掌握無(wú)菌技術(shù)，嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作規(guī)程。
無(wú)菌技術(shù)包括四部分內(nèi)容：實(shí)驗(yàn)所用的玻璃、塑料制品及金屬器械的處理；實(shí)驗(yàn)操作對(duì)象及試劑的無(wú)菌處理；工作環(huán)境及表面的處理；實(shí)驗(yàn)者的操作技術(shù)。前兩部分已在前面介紹過(guò)，這里主要介紹后兩部分內(nèi)容。
1. 周密計(jì)劃 在開(kāi)始實(shí)驗(yàn)前要制定好實(shí)驗(yàn)計(jì)劃和操作程序。有關(guān)數(shù)據(jù)的計(jì)算要事先做好。
2．仔細(xì)準(zhǔn)備 根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求，準(zhǔn)備各種所需的器材和物品，并選擇適宜的方法進(jìn)行包裝和除（滅）菌處理，清點(diǎn)無(wú)誤后將其放置操作場(chǎng)所(培養(yǎng)室、超凈工作臺(tái))內(nèi)。這樣可以避免開(kāi)始實(shí)驗(yàn)后因物品不全往返拿取而增加污染機(jī)會(huì)。
3．嚴(yán)格操作
實(shí)驗(yàn)進(jìn)行前，無(wú)菌室及超凈工作臺(tái)以紫外燈照射30?60min滅菌，以70%酒精擦拭無(wú)菌操作臺(tái)面，并開(kāi)啟無(wú)菌操作臺(tái)風(fēng)機(jī)運(yùn)轉(zhuǎn)10min后，再開(kāi)始實(shí)驗(yàn)操作。實(shí)驗(yàn)操作應(yīng)在超凈工作臺(tái)的中央無(wú)菌區(qū)域，不要在邊緣的非無(wú)菌區(qū)域操作。
為拿取方便，工作臺(tái)面上的用品要有合理的布局，原則上應(yīng)是右手使用的東西放置在右側(cè)，左手用品在左側(cè)，酒精燈置于中央。
在利用超凈臺(tái)工作時(shí)，因整個(gè)前臂要伸入箱內(nèi)，應(yīng)著長(zhǎng)袖的清潔工作服，并于開(kāi)始操作前要用75％酒精擦手或用消毒液洗手。如果實(shí)驗(yàn)過(guò)程中手觸及可能污染的物品和出入培養(yǎng)室都要重新用消毒液洗手。進(jìn)入細(xì)胞培養(yǎng)室需徹底洗手，戴口罩、著消毒衣帽及鞋等。
在無(wú)菌環(huán)境進(jìn)行培養(yǎng)或做其它無(wú)菌工作時(shí)，首先要點(diǎn)燃酒精燈或煤氣燈。以后一切操作，如安裝吸管帽、打開(kāi)或封閉瓶口等，都需在火焰近處并經(jīng)過(guò)燒灼進(jìn)行。但要注意：金屬器械不能在火焰中燒的時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，以防退火，燒過(guò)的金屬鑷要待冷卻后才能夾取組織，以免造成組織損傷。吸取過(guò)營(yíng)養(yǎng)液后的吸管不能再用火焰燒灼，因殘留在吸管頭中營(yíng)養(yǎng)液能燒焦形成炭膜，再用時(shí)會(huì)把有害物帶入營(yíng)養(yǎng)液中。開(kāi)啟、關(guān)閉長(zhǎng)有細(xì)胞或微生物的培養(yǎng)瓶時(shí)，火焰滅菌時(shí)間要短，防止因溫度過(guò)高燒死細(xì)胞或微生物。另外膠塞過(guò)火焰時(shí)也不能時(shí)間長(zhǎng)，以免燒焦產(chǎn)生有毒氣體，危害培養(yǎng)細(xì)胞。進(jìn)行無(wú)菌操作時(shí)，動(dòng)作要準(zhǔn)確敏捷，但又不必太快，以防空氣流動(dòng)，增加污染機(jī)會(huì)。不能用手觸及已消毒器皿，如已接觸，要用火焰燒灼消毒或取備用品更換。
工作由始至終要保持一定順序性，組織或細(xì)胞在未做處理之前，勿過(guò)早暴露在空氣中。同樣，培養(yǎng)用液及其他溶液在未用前，不要過(guò)早開(kāi)瓶；打開(kāi)瓶蓋進(jìn)行操作時(shí)，瓶口朝上與臺(tái)面呈45度角，減少落菌機(jī)會(huì)；用過(guò)之后如不再重復(fù)使用，應(yīng)立即封閉瓶口。吸取營(yíng)養(yǎng)液、PBS緩沖液、細(xì)胞懸液及其它各種用液時(shí)，均應(yīng)分別使用吸管，不能混用，以防影響試劑的效果、擴(kuò)大污染或?qū)е录?xì)胞交叉污染。工作中不能面向操作臺(tái)講話或咳嗽，以免唾沫把細(xì)菌或支原體帶入工作臺(tái)面發(fā)生污染。手或相對(duì)較臟的物品不能經(jīng)過(guò)開(kāi)放的瓶口上方，瓶口最易污染，加液時(shí)如吸管尖部碰到瓶口，則應(yīng)更換干凈吸管。
對(duì)于微生物或細(xì)胞而言，每次操作只處理一種微生物或一個(gè)細(xì)胞株，即使培養(yǎng)基相同也不要共享培養(yǎng)基，以免微生物或細(xì)胞間污染。
4．善始善終 實(shí)驗(yàn)完畢后，應(yīng)及時(shí)將實(shí)驗(yàn)物品及廢液帶出工作臺(tái)，關(guān)閉風(fēng)機(jī)，以70%酒精擦拭無(wú)菌操作臺(tái)面，關(guān)閉超凈工作臺(tái)的風(fēng)機(jī)和照明燈，實(shí)驗(yàn)結(jié)束。盡管每次實(shí)驗(yàn)前都會(huì)進(jìn)行工作臺(tái)面的消毒處理，但建議實(shí)驗(yàn)結(jié)束后立即打開(kāi)紫外燈進(jìn)行消毒，特別是在夏季，以防細(xì)菌或霉菌孳生。
無(wú)菌操作工作區(qū)域應(yīng)保持清潔及寬敞，必要物品，例如試管架、吸管吸取器或吸管盒等可以暫時(shí)放置，其他實(shí)驗(yàn)用品用完即取出，以利于空氣流通。
3.3微量操作技術(shù)
在過(guò)去的實(shí)驗(yàn)中，大家使用的重量和體積計(jì)量單位主要是克（g）和毫升（ml）及其以上者，而小于g和ml的單位如毫克（mg）、微克（?g）及微升（?l）等極少用到。從進(jìn)入分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)開(kāi)始，這些很小的計(jì)量單位都將經(jīng)常使用，甚至更小者如納克（ng）、皮克（pg）及納升（nl）等也將用到。由相對(duì)宏觀的操作突然轉(zhuǎn)為微量操作，對(duì)初學(xué)者來(lái)講需要有一個(gè)熟悉并熟練的過(guò)程，關(guān)鍵應(yīng)當(dāng)注意以下幾個(gè)方面的問(wèn)題。
1. 熟悉并掌握微量稱量器具的正確使用方法。微量電子天平（最小感量10-4g）和微量移液器（最大2?l）是兩種最常使用的器具，它們的使用方法請(qǐng)參考第2章有關(guān)內(nèi)容。準(zhǔn)確量取是微量操作的第一步，也是最重要的一步。
2. 添加。將一種或幾種液體物質(zhì)分別準(zhǔn)確量取后添加到同一個(gè)Eppendorf管中，必須保證看到每一種液體都加入其中，而且在取出移液器時(shí)，Tip頭的尖部不得帶出任何可見(jiàn)的液珠。
3. 混勻并集中。全部液體加完后，總體積只有10到幾十微升，難以用常規(guī)混勻的方法將各種成分徹底混勻。微量混勻的方法有：旋渦震蕩混勻和彈勻。將盛有液體的Eppendorf管蓋緊，握緊并將其底部與旋渦震蕩器接觸，液體會(huì)在管內(nèi)高速旋轉(zhuǎn)而混勻；也可手持蓋好的Eppendorf管上端（口部），另一只手反復(fù)彈動(dòng)其底部，將其中的液體混勻。最后，用高速臺(tái)式離心機(jī)將全部液體甩到Eppendorf管的底部。
4. 有時(shí)將極微量的物質(zhì)如DNA片段或質(zhì)粒DNA溶解在幾微升液體中，盡管看不見(jiàn)待溶解物質(zhì)，但將液體加入后，用上述同樣的方法進(jìn)行操作，也可很好將其溶解并混勻。
5. 由于微量操作，實(shí)驗(yàn)結(jié)果很難用肉眼直接觀察到。為了保證實(shí)驗(yàn)的順利進(jìn)行，在分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，每一步實(shí)驗(yàn)的結(jié)果都必須利用相關(guān)的檢測(cè)、鑒定方法顯示出來(lái)，判定正確后再進(jìn)行下一步反應(yīng)。這是所有科學(xué)實(shí)驗(yàn)的共同要求，但在分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中更應(yīng)當(dāng)強(qiáng)調(diào)和加以注意。

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