怎樣用發(fā)酵的方法生產(chǎn)耐高溫的阿爾法淀粉酶？

你好，我們是專業(yè)生產(chǎn)酶制劑的廠商，我們運用的是地衣芽孢桿菌，采用的是液體發(fā)酵方法，產(chǎn)生高溫淀粉酶耐高溫、酶活好。

淀粉酶高產(chǎn)菌的中試生產(chǎn)原理

原理,采用淀粉培養(yǎng)基原因:一般細(xì)菌不能直接利用淀粉為碳源,而產(chǎn)淀粉酶的菌株可以淀粉酶糖化淀粉 作為 c源,高溫可以殺死一般細(xì)菌,只有耐高溫的...

a-淀粉酶(a-l，4-glucan-glucanhydrolaseEC 3.2A1)又稱為液化型淀粉酶，它能從淀粉分 子的內(nèi)部任意切開a-l,4糖苷鍵，從而產(chǎn)生分子量比較小的麥芽糖糊精。淀粉在a-淀粉酶 的作用下，淀粉分子會迅速降解，粘度下降，即完成液化。a-淀粉酶具有相當(dāng)大的商業(yè)價 值，廣泛應(yīng)用于淀粉深加工工業(yè)、酒精工業(yè)、啤酒工業(yè)、檸檬酸工業(yè)、味精及淀粉糖化工 業(yè)、制藥工業(yè)及紡織業(yè)。(X-淀粉酶可由微生物發(fā)酵產(chǎn)生，也可由植物、動物提取，目前工 業(yè)生產(chǎn)上大都以微生物發(fā)酵法大規(guī)模生產(chǎn)a-淀粉酶。枯草桿菌、地衣芽孢桿菌、嗜熱脂肪 芽抱桿菌、米曲霉、黑曲霉等都是有實用價值的a-淀粉酶產(chǎn)生菌，由枯草芽孢桿菌AS 1.108 生產(chǎn)的中溫a-淀粉酶被廣泛應(yīng)用于淀粉深加工行業(yè)。

目前，現(xiàn)行大規(guī)模工業(yè)化淀粉水解工藝中的主流方向為使用耐高溫a-淀粉酶對淀粉進(jìn) 行瞬間高溫噴射液化，液化時淀粉醪的內(nèi)部溫度達(dá)到105-110°C。其應(yīng)用方法是1、在啤 酒釀造過程中，待輔料與水混合均勻后， 一次加入淀粉酶，迅速升溫，在95-97°C，保溫 30min左右。2、在酒精生產(chǎn)中，加入淀粉酶，pH6.5-7.0，攪勻后用泵送入蒸煮鍋或連續(xù) 蒸煮加熱器，溫度可控制在100±5°C，時間為100min，冷卻后糖化。3、在味精、淀粉糖 行業(yè)應(yīng)用時，調(diào)整pH至6.0-6.5，加入淀粉酶。如采用間隔液化，在液化罐中可迅速升溫 至100i5。C，在95-100'C保溫30min以上；如采用噴射液化，噴射溫度可在105。C左右， 并在95X:保溫60-120 min。耐高溫a-淀粉酶由于其熱穩(wěn)定性好，適合于在高溫下液化淀粉， 因此被廣泛應(yīng)用食品、制藥等行業(yè)。

但是，在水解過程中，由于需要長時間保溫，在水解及發(fā)酵過程中，對工業(yè)電及汽的 消耗是相當(dāng)大的。當(dāng)前，我國節(jié)能減排工作己進(jìn)入攻堅階段，作為我國十一五規(guī)劃中一 重要任務(wù)，已不僅是政府的一個行動目標(biāo)，而且還是每一個企業(yè)理應(yīng)承擔(dān)的社會責(zé)任，讓 城市居民能獲得一個較好的生存環(huán)境。節(jié)能減排更是一個人類解決環(huán)境問題的必經(jīng)之路。

通過攻關(guān)，為了使我國單位發(fā)酵產(chǎn)品耗水量、耗能量顯著減少，針對酶制劑在工業(yè)應(yīng) 用等方面存在的缺陷，進(jìn)行新品特異酶制劑的開發(fā)、研究酶基因篩選與酶功能的智能評價 技術(shù)、研究生物酶定向改造和分子設(shè)計技術(shù)、研究酶基因高效表達(dá)技術(shù)、酶生產(chǎn)下游關(guān)鍵 技術(shù)以及酶工程在淀粉制糖、生物制品生產(chǎn)等中的應(yīng)用技術(shù)非常重要。

因此，采用低壓噴射器加熱式中溫連續(xù)蒸煮工藝設(shè)備對淀粉進(jìn)行水解勢在必行。枯草 桿菌AS 1.108a-淀粉酶是我國產(chǎn)量最大用途最廣的一種高效液化型淀粉酶，它是由耐熱性 能高的枯草桿菌經(jīng)誘變后逐級擴(kuò)大培養(yǎng)、再經(jīng)提純而獲得的一種淺灰褐色粉末狀有臭味的 酶制劑，主要作用是能將原料中的淀粉質(zhì)液化為糊精，其在6(TC以下較為穩(wěn)定，最適作用溫度55-6(TC，在70-9(TC之間隨著溫度升高其反應(yīng)速度加快，但失活也加快，在75'C下 反應(yīng)10min或9(TC下工作5min，酶活力損失很少。但在75。C反應(yīng)30min時，酶活力喪失 1/3; 90'C下工作30min時，酶活力幾乎全部喪失。酶在pH6.0-7.0較為穩(wěn)定，最適作用 pH6.0-6.5， pH5.0以下失活較嚴(yán)重。

最近人們逐漸使用中溫-淀粉酶，由于其最適作用溫度在50-7(TC左右，所以其在淀 粉糊化時具有活性，而在焙烤過程中則會逐漸失活，最終在焙烤完成時活性喪失；而且，在 加工過程中a-淀粉酶會水解淀粉生成聚合度在4-9的糊精，這些糊精也具有抗老化性。但 是，現(xiàn)在中溫a-淀粉酶僅能從極少的一些微生物中提取。在淀粉工業(yè)中，由于a-淀粉酶在 適宜條件下對淀粉具有較強的水解能力，控制反應(yīng)的條件，可以控制淀粉的水解率，從而 將淀粉水解成多孔狀的多孔淀粉。淀粉在高溫條件下發(fā)生糊化，因此生產(chǎn)多孔淀粉多采用 中溫a-淀粉酶；另外，將a-淀粉酶和其它淀粉酶如糖化酶、普魯蘭酶等協(xié)同使用會提高反 應(yīng)效率和淀粉成孔效果。現(xiàn)在多孔淀粉的研制多采用a-淀粉酶和其它酶協(xié)同反應(yīng)，以淀粉 為漿料的紡織品退漿時，中溫a-淀粉酶尤其適用于不耐高溫的絲稠、化纖棉毛織品的退漿 工藝。

我國對細(xì)菌a-淀粉酶的研究作了大量工作。1965年我國開始應(yīng)用枯草芽孢桿菌AS 1.108生產(chǎn)a-淀粉酶，發(fā)酵單位為200U/mL左右，以后經(jīng)過長期不懈的努力，何紀(jì)春等以 AS 1.108變異株209出發(fā)，經(jīng)UV和NTG復(fù)合誘變，得到誘變株8a5，產(chǎn)酶活力比出發(fā)株 提高17-35%，而且具有比原株生長快、產(chǎn)酶早的優(yōu)點，中試和生產(chǎn)規(guī)模(x-淀粉酶活力分 別達(dá)到529U/mL和505U/mL，經(jīng)濟(jì)效益顯著。

近年來我國酶制劑工業(yè)蓬勃發(fā)展，品種產(chǎn)量也不斷增加，但是同國外酶制劑行業(yè)比較 尚有一段差距。國外中溫a-淀粉酶發(fā)酵水平達(dá)900U/mL (60'C下測定)，而我國中溫a-淀 粉酶發(fā)酵水平為300-500U/mL，因此亟需提高我國a-淀粉酶發(fā)酵水平，特別是為了節(jié)約工 業(yè)用糧，就需要運用基因工程手段，獲得中溫a-淀粉酶的高效表達(dá)，以顯著提高經(jīng)濟(jì)效益 和社會效益。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種中溫a-淀粉酶菌株及其構(gòu)建方法； 是將經(jīng)過PCR獲得的枯草芽孢桿菌AS 1.108中溫a-淀粉酶基因克隆到枯草芽孢桿菌表達(dá) 質(zhì)粒pWB980上，并轉(zhuǎn)入WB600，使中溫a-淀粉酶獲得高效表達(dá)。

本發(fā)明采取的技術(shù)方案是

一種中溫a-淀粉酶高產(chǎn)菌株，其出發(fā)菌枯草芽孢桿菌AS 1.108中溫a-淀粉酶基因核 苷酸序列如下

RALNDGADGFRFDAAKHIELPDDGSYGSQFWPNITNTSAEFQYGEILQDSASRDAAYADNKAGAGSFQVNDGKLTGTINARSVAVLYPDDIEIRCNTFFQ。

一種中溫a-淀粉酶高產(chǎn)菌株的構(gòu)建方法，其步驟是

(1) 枯草芽孢桿菌AS 1.108中溫a-淀粉酶基因的獲得及原核表達(dá)載體的構(gòu)建；

① 獲得根據(jù)genebank中已報道的枯草芽孢桿菌淀粉酶基因為依據(jù)，設(shè)計引物，利用 PCR得到中溫a-淀粉酶的成熟肽基因；

上游引物P1為5- CGCGGATCC CTTACAGCACCGTCGATCAA-3，下劃線部分為 5awHI酶切位點；

下游引物P2: 5- CCCAAGCTT AC TCAATGGGGAAGAGAACCG-3 ，下劃線部分為 ///m/III酶切位點；

模板為枯草芽孢桿菌AS 1.108基因組DNA，其擴(kuò)增的反應(yīng)條件為95。C預(yù)變性2 min， 以95。C變性30 s， 56。C退火30s， 72。C延伸lmin30s，擴(kuò)增30個循環(huán)，再以72 °C延伸20 min， PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)8g/L瓊脂糖凝膠電泳，將目的條帶切下，用DNA試劑盒回收純化， 得到中溫a-淀粉酶的成熟肽基因；

② 重組質(zhì)粒pET22twwy;的構(gòu)建與鑒定將得到中溫a-淀粉酶的成熟肽基因和載體 pET22b用萬amHI和/fz'mfll1雙酶切后，分別用DNA試劑盒回收純化酶切產(chǎn)物，在T4 DNA 連接酶作用下定向連接am;;至pET22b，將連接產(chǎn)物電擊轉(zhuǎn)化入DH5a感受態(tài)細(xì)菌中， 在LA(Amp)培養(yǎng)基中篩選培養(yǎng)，挑取陽性克隆，培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，采用ScwiHI和//!>1^11 雙位點單、雙酶切鑒定，測序；

(2) 枯草芽孢桿菌AS 1.108中溫a-淀粉酶基因的克隆和表達(dá)；

① .測序得到完整淀粉酶成熟肽基因，重新設(shè)計引物，更換酶切位點； 上游引物P3為5-CCCAAGCTT AC CTTACAGCACCGTCGATCAA-3，下劃線部分

為/Z/wdn酶切位點；

下游引物P4為5-CGCGGATCC TCAATGGGGAAGAGAACCG-3，下劃線部分為 5amHI酶切位點；

模板為重組質(zhì)粒pET22b-am擴(kuò)增的反應(yīng)條件為95'C預(yù)變性2min，以95'C變性 30 s， 56'C退火30s， 72。C延伸lmin30s，擴(kuò)增30個循環(huán)，再以72 。C延伸20 min， PCR擴(kuò) 增產(chǎn)物經(jīng)8g/L瓊脂糖凝膠電泳，將目的條帶切下，用DNA試劑盒回收純化，得到PCR 純化產(chǎn)物；

② .重組質(zhì)粒pWB980-am_y的構(gòu)建與鑒定將PCR純化產(chǎn)物和載體pWB980用BawHI

和/// ^111雙酶切后，分別用DNA試劑盒回收純化酶切產(chǎn)物，在T4DNA連接酶作用下

定向連接fl，至pWB980，將連接產(chǎn)物化學(xué)轉(zhuǎn)化入WB600感受態(tài)細(xì)菌中，在LA(Kan)

培養(yǎng)基中篩選培養(yǎng)，挑取陽性克隆，培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，采用SwHI和7^cffll雙位點單、

雙酶切鑒定，測序。

而且，所述將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入DH5a感受態(tài)細(xì)菌中的電擊轉(zhuǎn)化的方法為

(1) 在-80°C冰箱中取出感受態(tài)細(xì)胞置冰上融化，同時將電轉(zhuǎn)杯也放在冰上預(yù)冷；

(2) 打開電擊儀，調(diào)整到Ecl檔，電壓為1800V;

(3) 將上述連接產(chǎn)物10pL與感受態(tài)細(xì)菌40^L混合，在冰上震動電轉(zhuǎn)杯以確保細(xì)胞與 DNA懸液位于電轉(zhuǎn)杯底部；

(4) 用紙巾擦去電轉(zhuǎn)杯上的冷凝水和冰渣，放入電轉(zhuǎn)儀中，啟動對細(xì)胞的電脈沖；

(5) 脈沖結(jié)束后，盡可能快地取出電轉(zhuǎn)杯，室溫下迅速加入90(^LSOC培養(yǎng)液于電轉(zhuǎn) 杯中，混勻后轉(zhuǎn)入Ep管中，于37。C恒溫箱中培養(yǎng)lh;用培養(yǎng)lh的電轉(zhuǎn)產(chǎn)物涂布在LA(Amp) 平板上，倒置平皿于37。C恒溫箱中培養(yǎng)12-16h。

而且，所述將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入WB600感受態(tài)細(xì)菌中的化學(xué)轉(zhuǎn)化的方法為(1) 將活化的WB600轉(zhuǎn)接至3mlLB培養(yǎng)基中，37°C、 250 r/min培養(yǎng)過夜；取160 nl 上述培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接至8 ml SPI培養(yǎng)基，37°C ， 250 r/min培養(yǎng)至對數(shù)生長末期；

(2) 取0.2 ml步驟(l)獲得的培養(yǎng)液至2 ml SPII培養(yǎng)基中，37°C ， 100 r/min培養(yǎng)90 min;

(3) 加入20ul 1Ommol/L EGTA， 37°C ， 100 r/min培養(yǎng)10 min;

(4) 分裝成0.5ml每管，各加入5ulDNA， 37°C， 250r/min培養(yǎng)90 min，取菌液涂布篩 選平板。

而且，所述SPI培養(yǎng)基為SP鹽溶液加入1 %的濃度為50。/。葡萄糖溶液、1%的 100%CAYE，其中CAYE包括2%蛋白胨及10%酵母膏。

而且，所述SPII培養(yǎng)基為在SPI培養(yǎng)基加入1%的50mmol/L CaCl2溶液、1 %的250 mmol/LMgCl2溶液。

而且，所述AS 1.108淀粉酶基因原核表達(dá)載體pWB980，大小為1112bp，具有P43 啟動子，^cS信號肽序列，卡那霉素抗性標(biāo)志。 本發(fā)明的優(yōu)點和積極效果是

本發(fā)明利用表達(dá)載體pWB980，首次實現(xiàn)了去信號肽的枯草芽孢桿菌AS 1.108中溫a-淀粉酶基因(flw少)在枯草芽孢桿菌WB600中的高效表達(dá)。該基因含有1,431個堿基， 編碼447個氨基酸。經(jīng)SDS-PAGE檢測，重組酶(AMY)的分子質(zhì)量為49.1KDa，最適 的作用溫度和pH分別為6(TC和6.0。該酶的酶活是出發(fā)菌株的2倍左右，并解決了出發(fā) 菌株在發(fā)酵過程中產(chǎn)生的臭味和發(fā)酵周期長的難題。不但節(jié)約了工業(yè)用糧，降低了成本， 給淀粉原料的深加工提供了更好的條件，而且極大的減少了能源的消耗，更適用于工業(yè)化 的生產(chǎn)和應(yīng)用，不僅具有重要的經(jīng)濟(jì)效益，也具有明顯的社會效益。

圖l為本發(fā)明a-淀粉酶基因與原核表達(dá)載體pET22b的構(gòu)建示意圖2為本發(fā)明a-淀粉酶基因與原核表達(dá)載體pWB980的構(gòu)建示意圖3為本發(fā)明重組酶最適溫度測定曲線圖4為本發(fā)明重組酶耐熱性測定曲線圖5為本發(fā)明重組酶最適pH測定曲線圖6為本發(fā)明重組酶pH穩(wěn)定性測定曲線圖。

具體實施例方式

下面結(jié)合實施例，對本發(fā)明進(jìn)一步說明，下述實施例是說明性的，不是限定性的，不 能以下述實施例來限定本發(fā)明的保護(hù)范圍。

一種中溫a-淀粉酶高產(chǎn)菌株，其出發(fā)菌枯草芽孢桿菌AS 1.108中溫a-淀粉酶基因核 苷酸序列如下

RALNDGADGFRFDAAKHIELPDDGSYGSQFWPN

標(biāo)簽：淀粉酶中試高產(chǎn)