怎樣用發酵的方法生產耐高溫的阿爾法淀粉酶？

你好，我們是專業生產酶制劑的廠商，我們運用的是地衣芽孢桿菌，采用的是液體發酵方法，產生高溫淀粉酶耐高溫、酶活好。

淀粉酶高產菌的中試生產原理

原理,采用淀粉培養基原因:一般細菌不能直接利用淀粉為碳源,而產淀粉酶的菌株可以淀粉酶糖化淀粉 作為 c源,高溫可以殺死一般細菌,只有耐高溫的...

a-淀粉酶(a-l，4-glucan-glucanhydrolaseEC 3.2A1)又稱為液化型淀粉酶，它能從淀粉分 子的內部任意切開a-l,4糖苷鍵，從而產生分子量比較小的麥芽糖糊精。淀粉在a-淀粉酶 的作用下，淀粉分子會迅速降解，粘度下降，即完成液化。a-淀粉酶具有相當大的商業價 值，廣泛應用于淀粉深加工工業、酒精工業、啤酒工業、檸檬酸工業、味精及淀粉糖化工 業、制藥工業及紡織業。(X-淀粉酶可由微生物發酵產生，也可由植物、動物提取，目前工 業生產上大都以微生物發酵法大規模生產a-淀粉酶。枯草桿菌、地衣芽孢桿菌、嗜熱脂肪 芽抱桿菌、米曲霉、黑曲霉等都是有實用價值的a-淀粉酶產生菌，由枯草芽孢桿菌AS 1.108 生產的中溫a-淀粉酶被廣泛應用于淀粉深加工行業。

目前，現行大規模工業化淀粉水解工藝中的主流方向為使用耐高溫a-淀粉酶對淀粉進 行瞬間高溫噴射液化，液化時淀粉醪的內部溫度達到105-110°C。其應用方法是1、在啤 酒釀造過程中，待輔料與水混合均勻后， 一次加入淀粉酶，迅速升溫，在95-97°C，保溫 30min左右。2、在酒精生產中，加入淀粉酶，pH6.5-7.0，攪勻后用泵送入蒸煮鍋或連續 蒸煮加熱器，溫度可控制在100±5°C，時間為100min，冷卻后糖化。3、在味精、淀粉糖 行業應用時，調整pH至6.0-6.5，加入淀粉酶。如采用間隔液化，在液化罐中可迅速升溫 至100i5。C，在95-100'C保溫30min以上；如采用噴射液化，噴射溫度可在105。C左右， 并在95X:保溫60-120 min。耐高溫a-淀粉酶由于其熱穩定性好，適合于在高溫下液化淀粉， 因此被廣泛應用食品、制藥等行業。

但是，在水解過程中，由于需要長時間保溫，在水解及發酵過程中，對工業電及汽的 消耗是相當大的。當前，我國節能減排工作己進入攻堅階段，作為我國十一五規劃中一 重要任務，已不僅是政府的一個行動目標，而且還是每一個企業理應承擔的社會責任，讓 城市居民能獲得一個較好的生存環境。節能減排更是一個人類解決環境問題的必經之路。

通過攻關，為了使我國單位發酵產品耗水量、耗能量顯著減少，針對酶制劑在工業應 用等方面存在的缺陷，進行新品特異酶制劑的開發、研究酶基因篩選與酶功能的智能評價 技術、研究生物酶定向改造和分子設計技術、研究酶基因高效表達技術、酶生產下游關鍵 技術以及酶工程在淀粉制糖、生物制品生產等中的應用技術非常重要。

因此，采用低壓噴射器加熱式中溫連續蒸煮工藝設備對淀粉進行水解勢在必行。枯草 桿菌AS 1.108a-淀粉酶是我國產量最大用途最廣的一種高效液化型淀粉酶，它是由耐熱性 能高的枯草桿菌經誘變后逐級擴大培養、再經提純而獲得的一種淺灰褐色粉末狀有臭味的 酶制劑，主要作用是能將原料中的淀粉質液化為糊精，其在6(TC以下較為穩定，最適作用溫度55-6(TC，在70-9(TC之間隨著溫度升高其反應速度加快，但失活也加快，在75'C下 反應10min或9(TC下工作5min，酶活力損失很少。但在75。C反應30min時，酶活力喪失 1/3; 90'C下工作30min時，酶活力幾乎全部喪失。酶在pH6.0-7.0較為穩定，最適作用 pH6.0-6.5， pH5.0以下失活較嚴重。

最近人們逐漸使用中溫-淀粉酶，由于其最適作用溫度在50-7(TC左右，所以其在淀 粉糊化時具有活性，而在焙烤過程中則會逐漸失活，最終在焙烤完成時活性喪失；而且，在 加工過程中a-淀粉酶會水解淀粉生成聚合度在4-9的糊精，這些糊精也具有抗老化性。但 是，現在中溫a-淀粉酶僅能從極少的一些微生物中提取。在淀粉工業中，由于a-淀粉酶在 適宜條件下對淀粉具有較強的水解能力，控制反應的條件，可以控制淀粉的水解率，從而 將淀粉水解成多孔狀的多孔淀粉。淀粉在高溫條件下發生糊化，因此生產多孔淀粉多采用 中溫a-淀粉酶；另外，將a-淀粉酶和其它淀粉酶如糖化酶、普魯蘭酶等協同使用會提高反 應效率和淀粉成孔效果。現在多孔淀粉的研制多采用a-淀粉酶和其它酶協同反應，以淀粉 為漿料的紡織品退漿時，中溫a-淀粉酶尤其適用于不耐高溫的絲稠、化纖棉毛織品的退漿 工藝。

我國對細菌a-淀粉酶的研究作了大量工作。1965年我國開始應用枯草芽孢桿菌AS 1.108生產a-淀粉酶，發酵單位為200U/mL左右，以后經過長期不懈的努力，何紀春等以 AS 1.108變異株209出發，經UV和NTG復合誘變，得到誘變株8a5，產酶活力比出發株 提高17-35%，而且具有比原株生長快、產酶早的優點，中試和生產規模(x-淀粉酶活力分 別達到529U/mL和505U/mL，經濟效益顯著。

近年來我國酶制劑工業蓬勃發展，品種產量也不斷增加，但是同國外酶制劑行業比較 尚有一段差距。國外中溫a-淀粉酶發酵水平達900U/mL (60'C下測定)，而我國中溫a-淀 粉酶發酵水平為300-500U/mL，因此亟需提高我國a-淀粉酶發酵水平，特別是為了節約工 業用糧，就需要運用基因工程手段，獲得中溫a-淀粉酶的高效表達，以顯著提高經濟效益 和社會效益。

發明內容

本發明的目的在于克服現有技術的不足，提供一種中溫a-淀粉酶菌株及其構建方法； 是將經過PCR獲得的枯草芽孢桿菌AS 1.108中溫a-淀粉酶基因克隆到枯草芽孢桿菌表達 質粒pWB980上，并轉入WB600，使中溫a-淀粉酶獲得高效表達。

本發明采取的技術方案是

一種中溫a-淀粉酶高產菌株，其出發菌枯草芽孢桿菌AS 1.108中溫a-淀粉酶基因核 苷酸序列如下

RALNDGADGFRFDAAKHIELPDDGSYGSQFWPNITNTSAEFQYGEILQDSASRDAAYADNKAGAGSFQVNDGKLTGTINARSVAVLYPDDIEIRCNTFFQ。

一種中溫a-淀粉酶高產菌株的構建方法，其步驟是

(1) 枯草芽孢桿菌AS 1.108中溫a-淀粉酶基因的獲得及原核表達載體的構建；

① 獲得根據genebank中已報道的枯草芽孢桿菌淀粉酶基因為依據，設計引物，利用 PCR得到中溫a-淀粉酶的成熟肽基因；

上游引物P1為5- CGCGGATCC CTTACAGCACCGTCGATCAA-3，下劃線部分為 5awHI酶切位點；

下游引物P2: 5- CCCAAGCTT AC TCAATGGGGAAGAGAACCG-3 ，下劃線部分為 ///m/III酶切位點；

模板為枯草芽孢桿菌AS 1.108基因組DNA，其擴增的反應條件為95。C預變性2 min， 以95。C變性30 s， 56。C退火30s， 72。C延伸lmin30s，擴增30個循環，再以72 °C延伸20 min， PCR擴增產物經8g/L瓊脂糖凝膠電泳，將目的條帶切下，用DNA試劑盒回收純化， 得到中溫a-淀粉酶的成熟肽基因；

② 重組質粒pET22twwy;的構建與鑒定將得到中溫a-淀粉酶的成熟肽基因和載體 pET22b用萬amHI和/fz'mfll1雙酶切后，分別用DNA試劑盒回收純化酶切產物，在T4 DNA 連接酶作用下定向連接am;;至pET22b，將連接產物電擊轉化入DH5a感受態細菌中， 在LA(Amp)培養基中篩選培養，挑取陽性克隆，培養后提取質粒，采用ScwiHI和//!>1^11 雙位點單、雙酶切鑒定，測序；

(2) 枯草芽孢桿菌AS 1.108中溫a-淀粉酶基因的克隆和表達；

① .測序得到完整淀粉酶成熟肽基因，重新設計引物，更換酶切位點； 上游引物P3為5-CCCAAGCTT AC CTTACAGCACCGTCGATCAA-3，下劃線部分

為/Z/wdn酶切位點；

下游引物P4為5-CGCGGATCC TCAATGGGGAAGAGAACCG-3，下劃線部分為 5amHI酶切位點；

模板為重組質粒pET22b-am擴增的反應條件為95'C預變性2min，以95'C變性 30 s， 56'C退火30s， 72。C延伸lmin30s，擴增30個循環，再以72 。C延伸20 min， PCR擴 增產物經8g/L瓊脂糖凝膠電泳，將目的條帶切下，用DNA試劑盒回收純化，得到PCR 純化產物；

② .重組質粒pWB980-am_y的構建與鑒定將PCR純化產物和載體pWB980用BawHI

和/// ^111雙酶切后，分別用DNA試劑盒回收純化酶切產物，在T4DNA連接酶作用下

定向連接fl，至pWB980，將連接產物化學轉化入WB600感受態細菌中，在LA(Kan)

培養基中篩選培養，挑取陽性克隆，培養后提取質粒，采用SwHI和7^cffll雙位點單、

雙酶切鑒定，測序。

而且，所述將連接產物轉化入DH5a感受態細菌中的電擊轉化的方法為

(1) 在-80°C冰箱中取出感受態細胞置冰上融化，同時將電轉杯也放在冰上預冷；

(2) 打開電擊儀，調整到Ecl檔，電壓為1800V;

(3) 將上述連接產物10pL與感受態細菌40^L混合，在冰上震動電轉杯以確保細胞與 DNA懸液位于電轉杯底部；

(4) 用紙巾擦去電轉杯上的冷凝水和冰渣，放入電轉儀中，啟動對細胞的電脈沖；

(5) 脈沖結束后，盡可能快地取出電轉杯，室溫下迅速加入90(^LSOC培養液于電轉 杯中，混勻后轉入Ep管中，于37。C恒溫箱中培養lh;用培養lh的電轉產物涂布在LA(Amp) 平板上，倒置平皿于37。C恒溫箱中培養12-16h。

而且，所述將連接產物轉化入WB600感受態細菌中的化學轉化的方法為(1) 將活化的WB600轉接至3mlLB培養基中，37°C、 250 r/min培養過夜；取160 nl 上述培養液轉接至8 ml SPI培養基，37°C ， 250 r/min培養至對數生長末期；

(2) 取0.2 ml步驟(l)獲得的培養液至2 ml SPII培養基中，37°C ， 100 r/min培養90 min;

(3) 加入20ul 1Ommol/L EGTA， 37°C ， 100 r/min培養10 min;

(4) 分裝成0.5ml每管，各加入5ulDNA， 37°C， 250r/min培養90 min，取菌液涂布篩 選平板。

而且，所述SPI培養基為SP鹽溶液加入1 %的濃度為50。/。葡萄糖溶液、1%的 100%CAYE，其中CAYE包括2%蛋白胨及10%酵母膏。

而且，所述SPII培養基為在SPI培養基加入1%的50mmol/L CaCl2溶液、1 %的250 mmol/LMgCl2溶液。

而且，所述AS 1.108淀粉酶基因原核表達載體pWB980，大小為1112bp，具有P43 啟動子，^cS信號肽序列，卡那霉素抗性標志。 本發明的優點和積極效果是

本發明利用表達載體pWB980，首次實現了去信號肽的枯草芽孢桿菌AS 1.108中溫a-淀粉酶基因(flw少)在枯草芽孢桿菌WB600中的高效表達。該基因含有1,431個堿基， 編碼447個氨基酸。經SDS-PAGE檢測，重組酶(AMY)的分子質量為49.1KDa，最適 的作用溫度和pH分別為6(TC和6.0。該酶的酶活是出發菌株的2倍左右，并解決了出發 菌株在發酵過程中產生的臭味和發酵周期長的難題。不但節約了工業用糧，降低了成本， 給淀粉原料的深加工提供了更好的條件，而且極大的減少了能源的消耗，更適用于工業化 的生產和應用，不僅具有重要的經濟效益，也具有明顯的社會效益。

圖l為本發明a-淀粉酶基因與原核表達載體pET22b的構建示意圖2為本發明a-淀粉酶基因與原核表達載體pWB980的構建示意圖3為本發明重組酶最適溫度測定曲線圖4為本發明重組酶耐熱性測定曲線圖5為本發明重組酶最適pH測定曲線圖6為本發明重組酶pH穩定性測定曲線圖。

具體實施例方式

下面結合實施例，對本發明進一步說明，下述實施例是說明性的，不是限定性的，不 能以下述實施例來限定本發明的保護范圍。

一種中溫a-淀粉酶高產菌株，其出發菌枯草芽孢桿菌AS 1.108中溫a-淀粉酶基因核 苷酸序列如下

RALNDGADGFRFDAAKHIELPDDGSYGSQFWPN

標簽：淀粉酶中試高產