測定蛋白質(zhì)的方法可分為兩大類：一類是利用蛋白質(zhì)的物理化學性質(zhì)來推算，如密度、折射率、紫外吸收、熒光性等；另一類是利用化學方法來計算，如定氮、雙縮脲反應、染料結(jié)合反應、酚試劑反應等 主要測定方法有：雙縮脲法、染料結(jié)合法、酚試劑法、紫外分光光度法、水揚酸比色法、折光法、旋光法、近紅外光譜法. 目前蛋白質(zhì)測定最常用的方法是凱氏定氮法，是通過測總氮量來確定蛋白質(zhì)含量的方法。 凱氏定氮法是通過測出樣品中的總含氮量再乘以相應的蛋白質(zhì)系數(shù)而求出蛋白質(zhì)的含量,此法的結(jié)果稱為粗蛋白質(zhì)含量：由于樣品中含有少量非蛋白質(zhì)含氮化合物，如核酸、生物堿、含氮類脂、卟啉以及含氮色素等非蛋白質(zhì)的含氮化合物.凱氏定氮法是測定總有機氮量較為準確、操作較為簡單的方法之一，可用于所有動、植物食品的分析及各種加工食品的分析，可同時測定多個樣品，故國內(nèi)外應用較為普遍，是個經(jīng)典分析方法[6]。至今仍被作為標準檢驗方法.此法可應用于各類食品中蛋白質(zhì)含量測定 凱氏定氮法可分為全量法、微量法及經(jīng)改進后的改良凱氏定氮法目前通常以硫酸銅作催化劑的常量、半微量、微量凱氏定氮法樣品質(zhì)量及試劑用量較少，且有一套微量凱氏定氮器。在凱氏法改良中主要的問題是，氮化合物中氮的完全氨化問題及縮短時間、簡化操作的問題，即分解試樣所用的催化劑。常量改良凱氏定氮法在催化劑中增加了二氧化鈦[4]. 在理化實驗室,檢驗食品中蛋白質(zhì)的含量通常用微量凱氏定氮法和全量凱氏定氮法.接下來以大量的試驗來比較微量凱氏定氮法和全量凱氏定氮法的精確度的大小. 1.材料與方法： 1.1試驗材料 1.1.1試驗樣品 面粉 1.1.2試驗藥品和試劑 所有試劑均為分析純；水為蒸餾水或同等純度的水。 硫酸銅； 硫酸鉀； 濃硫酸； 40％氫氧化鈉溶液：稱取40g氫氧化鈉溶于60mL蒸餾水中； 4％硼酸溶液：稱取4g硼酸溶于蒸餾水中稀釋至lOOmL； 0．1mol／L鹽酸標準滴定溶液； 甲基紅次甲基藍混合指示液：將次甲基藍乙醇溶液(1g／L)與甲基紅乙醇溶液(1g／L)按1+2體積比混合。 1.1.3儀器和設備： 實驗室常規(guī)儀器及下列各項： 凱氏燒瓶：500mL； 可調(diào)式電爐；蒸汽蒸餾裝置； 鉸肉機： 篦孔徑不超過4nm； 組織搗碎機； 粉碎機； 研缽：玻璃或瓷質(zhì)； 化學消化器， 凱氏定氮儀， 空氣濾過器 1.2試驗方法 1.2.1微量凱氏定氮法 微量凱氏定氮法的原理 樣品與濃硫酸和催化劑一同加熱消化，使蛋白質(zhì)分解，其中碳和氫被氧化為二氧化碳和水逸出，而樣品中的有機氮轉(zhuǎn)化為氨與硫酸結(jié)合成硫酸銨。然后取消化液的1/10加堿蒸餾，使氨蒸出，用硼酸吸收后再以標準鹽酸或硫酸溶液滴定[2]。根據(jù)標準酸消耗量可計算出蛋白質(zhì)的含量。包括消化、蒸餾、吸收、滴定四個步驟 1.2.2全量凱氏定氮法 全量凱氏定氮法的原理 樣品與濃硫酸和催化劑一同加熱消化，使蛋白質(zhì)分解，其中碳和氫被氧化為二氧化碳和水逸出，而樣品中的有機氮轉(zhuǎn)化為氨與硫酸結(jié)合成硫酸銨。然后取消化液的全部加堿蒸餾，使氨蒸出，用硼酸吸收后再以標準鹽酸或硫酸溶液滴定。根據(jù)標準酸消耗量可計算出蛋白質(zhì)的含量。包括消化、蒸餾、吸收、滴定四個步驟 2 分析過程 試樣制備：固體樣品：取有代表性的樣品至少200g，用研缽搗碎、研細；不易搗碎、研細的樣品應切(剪)成細粒；干固體樣品用粉碎機粉碎；液體樣品：取充分混勻的液體樣品至少200g。粉狀樣品：取有代表性的樣品至少200g(如粉粒較大也應用研缽研細)，混合均勻；糊狀樣品：取有代表性的樣品至少200g，混合均勻；固液體樣品：按固、液體比例，取有代表性的樣品至少200g，用組織搗碎機搗碎，混合均勻；肉制品：取去除不可食部分、具有代表性的樣品至少200g，用鉸肉機至少鉸兩次，混合均勻。上述試樣應放入密閉玻璃容器中，于4°C冰箱內(nèi)貯存?zhèn)溆茫M快測定。 2.1微量凱氏定氮法的分析過程 2.1.1樣品消化 : 步驟：準確稱取一定量的樣品，加入硫酸銅0.5g、硫酸鉀10g和濃硫酸20mL、玻璃珠數(shù)粒→小心移入干燥潔凈的500ml凱氏燒瓶中(固體或粉末用紙卷成紙筒送入)，輕輕搖勻，以45o斜支于有小孔的石棉網(wǎng)上→用電爐以小火加熱(或先燒瓶放在距電爐較遠處)，待內(nèi)容物全部炭化、泡沫停止產(chǎn)生后→加大火力(或?qū)糠旁陔姞t上)，保持瓶內(nèi)液體微沸→至液體變藍綠色透明后→繼續(xù)加熱微沸30min→關(guān)閉電爐，取下燒瓶、冷卻→轉(zhuǎn)移至100ml容量瓶中，加水定容 2.1.2 蒸餾與吸收： 按圖安裝好微量定氮蒸餾裝置。于水蒸氣發(fā)生瓶內(nèi)裝水至2/3容積處，加甲基橙指示劑數(shù)滴及硫酸數(shù)毫升，以保持水呈酸性，加入數(shù)粒玻璃珠。在接受瓶中加入10ml40g/L硼酸及2滴混合指示劑，將冷凝管下端插入液面以下。準確吸取消化液10mL于反應管內(nèi)，經(jīng)漏斗再加入10mL氫氧化鈉溶液，用少量蒸餾水沖洗漏斗，夾好漏斗夾并水封，加熱煮沸水蒸氣發(fā)生瓶內(nèi)的水進行蒸餾。指示劑變綠色后繼續(xù)蒸餾10min，將冷凝管尖端提離液面繼續(xù)蒸1min

標簽：測定步驟關(guān)鍵